5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)是一种重要的功能性非蛋白原氨基酸,广泛应用于医药和农药领域,备受国内外有关学者的关注。目前其生物合成法主要采用大肠selleck HPLC杆菌和谷氨酸棒杆菌为宿主。在C4和C5两种合成途径中,C5合成途径Medical cannabinoids (MC)需由谷氨酸经过三步酶促反应生成ALA,调控比较复杂。而C4途径仅需一步反应,通过ALA合成酶(5-Aminolevulinic acid synthetase,ALAS,hem A基因编码)催化琥珀酰辅酶A与甘氨酸的醛缩反应来合成ALA,研究较为Colforsin IC50广泛。本论文对C4途径ALAS进行突变,以期进一步提高酶活力,更加高效地合成ALA。前期工作表明,在谷氨酸棒状杆菌中,Rhodobacter capsulatus来源的ALAS活性较高,于是本论文以该酶为基础进行了突变筛选。主要研究结果如下:(1)采用RED同源重组方法敲除了大肠杆菌hem A基因,构建了大肠杆菌ALA营养缺陷型菌株。(2)提出生长偶联及荧光辅助的ALAS突变体筛选策略并进行了模型验证。异源表达的ALAS能够回补缺陷菌株DH5α△hem A的生长,从而将ALAS的酶活力与缺陷菌株的生长状况偶联起来。模型验证实验中,将质粒pSB(R.capsulatus ALAS表达质粒)和pSB*1(ALAS,H342A)分别转化至DH5α△hem A,等比例混合后涂布平板,发现pSB质粒转入后的ALA合成能力较强,其对应的单菌落也较大,同时卟啉荧光强度也较高,表明了筛选策略的可行性。(3)优化筛选条件,提高筛选效率和准确性。具体内容包括前体物添加、培养基成分、接种量、菌种活化方式等。结果表明,将新活化的单菌落接种培养后,以5%接种量在添加葡萄糖、IPTG、卡那霉素、甘氨酸的条件下,采用ALA发酵培养基摇瓶发酵时,有利于ALAS突变体的筛选。采用优化后的筛选条件,筛选效率由40%提高到95%。(4)对ALAS进行全序列随机突变和催化结构域突变,并进行筛选。通过全序列随机突变得到的两个突变子与野生型相比,单位细胞的ALA积累量分别提高了13%、15%,但是糖耗明显减慢;通过催化结构域突变得到的四个突变子与野生型相比,ALA积累量分别提高了29%、28%、26%、13%。对筛选得到的六个突变子进行酶活检测。其中通过全序列随机突变得到的两个突变子的酶活较野生菌并没有明显差异;通过催化结构域突变得到的四个突变子中有两个突变子的酶活较野生菌显著降低,有两个突变子的酶活较野生菌显著增高,ALAS比酶活较野生菌DH5α△hem A/pSB分别提高了10.2%、16.5%,分别达到43.01 U/mg、45.47 U/mg。综上所述,本研究得到了两个ALA合成能力和酶活都较野生菌DH5α△hem A/pSB显著提高的突变子。提高了ALAS的催化活性,构建更加高效的ALA合成途径和高效生产ALA的重组大肠杆菌,为细胞工厂生产ALA奠定了一定的科学基础。