鱼糜是极其重要的水产食品原料,冷冻贮藏是鱼糜的典型存放方式。但冷冻效应会导致鱼糜蛋白浓缩变性和冰晶生长,致使鱼糜蛋白功能特性和鱼糜品质劣化。一般采用糖类作为鱼糜的冷冻保护剂,抑制蛋白质的冷冻变性。魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan,KGM)作为亲水性天然多糖,具备优越的凝胶性、持水性、增稠性,被认为是潜在的鱼糜抗冻剂,但其分子量大、吸水性强,难以均匀分散在食品基质中。酶法降解可显著改善KGM的食品基质分散性,而且KGM酶解产物可对鱼糜肌原纤维蛋白组分发挥冷冻保护作用,从而提升鱼糜品质,但相关机制亟待系统研究。因此,本文采用β-葡聚糖酶制备不同分子量的KGM酶解产物,在明确产物结构与特性的基础上,研究了不同分子量KGM酶解产物添加量对草鱼鱼糜凝胶结构与性质的影响;剖析了不同分子量KGM酶解产物对草鱼肌原纤维蛋白和鱼糜的冷冻保护作用;从KGM酶解产物与肌球蛋白分子相互作用的角度,阐明了KGM酶解产物的冷冻保护作用机制。研究结果可为鱼糜冻藏过程中的品质控制与提升提供理论依据。主要研究结果如下:1.研究了β-葡聚糖酶在不同水解条件下得到的KGM酶解产物的结构与特性。酶解产物分子量在36.48±1.23至149.03±1.91 kDa范围内;随着分子量降低,KGM酶解产物的特征粘度降低、脱乙酰度上升、可溶性总糖含量降低、白度增加;KGM及酶解产物主要呈无定形态,但较低分子量的KGM酶解产物具有少量的结晶结构,酶解产物表面羟基含量随着分子量下降而逐渐增加。而且酶解过程中的脱乙酰作用对KGM的微观形貌具有破坏作用,Zeta电位显示KGM酶解产物的电负性呈上升趋势。2.研究了不同分子量KGM酶解产物添加量对草鱼鱼糜结构与凝胶特性的影响。结果显示,KGM酶解产物在鱼糜凝胶中存在自聚集和延伸两种状态,在鱼糜凝胶基质中KGM酶解产物同步发生自聚集以及与蛋白质分子的相互作用。分子量149.03±1.91和128.7±5.9 kDa的KGM酶解产物的添加有利于增强鱼糜的凝胶强度;当KGM酶解产物添加量为1%时,鱼糜自由水含量增加、凝胶持水性降低;当KGM酶解产物添加量为0.5%时,鱼糜凝胶强度无显著变化,鱼糜具有良好保水性。因此,KGM酶解产物的适宜添加量为0.5%。3.在0.5%的酶解产物添加量下,研究了不同分子量的KGM酶解产物对于肌原纤维蛋白和鱼糜冷冻保护作用。随着冻藏selleck时间延长,盐溶性蛋白含量、酶活性(Ca~(2+)-ATPase酶)、总巯基含量、Zeta电位值降低,表面疏水性和蛋白质粒径升高;随着KGM酶解产物分子量降低,肌原纤维蛋白含量、酶活性(Ca~(2+)-ATPase酶)和总巯基含量逐渐增加,表面疏水性和Zeta电位逐渐减小,芳香族氨基酸残基(色氨酸、酪氨酸)的暴露程度减小;小分子量的KGM酶解产物(EK3)对肌原纤维蛋白的冷冻保护作用最佳。随着冻藏时间延长,鱼糜的持水性、离子键含量、α-螺旋含量逐渐降低,蒸煮失水率、无规卷曲含量逐渐上升,氢键和疏水键含量呈现先上升后下降的趋势;118.75±2.76 kDa(EK2)和36.48±1.23 kDa(EK3)的KGM酶解产物在降低鱼糜蒸煮失水率、改善鱼糜热稳定性、提高疏水键含量、延缓α-螺旋含量下thoracic medicine降等方面均有显著效果,EK2和EK3对鱼糜冷冻保护作用明显。通过研究KGM酶解产物对鱼糜蛋白肽段的氧化作用位点,发寻找更多现冻藏30 d后空白组鱼糜蛋白MHC和Actin条带强度明显降低,肽链的氧化主要与Met有关,而添加EK3可保护原被氧化的大部分肽链;肽段的氧化位点主要位于肌球蛋白头部区域,添加EK3后鱼糜片段在肌球蛋白头部的氧化位点明显减少,杆部的氧化位点数量无差异。因此,KGM酶解产物可能通过保护肌球蛋白头部的易氧化位点来发挥冷冻保护作用。4.结合上述研究,探讨了基于KGM酶解产物-肌球蛋白相互作用的冷冻保护机制。KGM酶解产物(EK)可保护肌球蛋白表面疏水基团,避免暴露;EK-肌球蛋白的相互作用力主要是氢键、范德华力,EK-肌球蛋白形成的氢键较肌球蛋白分子间的氢键更稳定;添加EK能改变肌球蛋白构象,提高肌球蛋白的热稳定性,特别是轻酶解肌球蛋白和重酶解肌球蛋白部分,EK可能与这两个部分结合。不同产物分子量下的研究表明,EK1(149.03±1.91 kDa)与肌球蛋白相互作用的焓变和熵变低于EK2和EK3,EK1对肌球蛋白的吸附作用小于EK2和EK3,EK2和EK3吸附肌球蛋白的质量和厚度无显著差异。分子模拟验证了KGM酶解产物分子链可在肌球蛋白二聚体表面形成的空腔中,与肌球蛋白形成氢键,稳定肌球蛋白结构,这与实验结果相吻合。KGM分子尺寸效应可能体现在EK1和EK2之间,酶解时间延长导致产物分子量下降、脱乙酰度下降、特征粘度下降,使酶解产物分子与肌球蛋白头部充分结合,在冷冻过程中可形成空间位阻,从而抑制肌球蛋白头部的聚集,从而发挥冷冻保护作用。