微生物胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)因其低成本、标准化、高质量、可持续生产、多样性和优良的理化性质等特点,导致了学术界和工业Rapamycin界的研究热潮,并迅速成为具有经济竞争力的产品。硬葡聚糖(scleroglucan,β-(1,3)-(1,6)-glucan)是由某些真菌分泌的一种胞外多糖,结构为独特的三螺旋。硬葡聚糖有优良的非离子水溶性、生物相容性、假塑性、耐水解性、耐盐性、保湿性、粘度稳定性等理化性质,广泛应用于工业、食品、医药和化妆品等行业,商业价值极高。尽管硬葡聚糖应用前景巨大,但是却面临着底物利用率低、产量低和生产成本高等问题,严重限制了硬葡聚糖的应用开发。目前,工业生产硬葡聚糖主要依赖丝状真菌小核菌属的发酵。所用的典型菌株是齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。已有大量关于齐整小核菌产硬葡聚糖的研究,主要关注于硬葡聚糖的理化性质,及通过发酵条件优化从而提高硬葡聚糖产量等方面。但是,在充分理解硬葡聚糖生物合成途径的基础上,设计合适的代谢流调整方案,构建代谢工程菌,从而在菌株性状层面实现硬葡聚糖的高产化、或者减少副产物以提高底物利用率、或者利用废弃生物质原料为底物等目的的研究几乎没有进展。这主要是因为齐整小核菌缺乏进行代谢工程改造所必需的遗传操作技术体系(包括遗传转化方法和质粒高效构建系统),以及人们对硬葡聚糖生物合成途径相关基因的功能知之甚少。因此,针对齐整小核菌代谢工程研究存在的上述两个难题,本研究致力于建立和完善齐整小核菌代谢工程遗传操作技术体系,并利用此系统对预测的硬葡聚糖合成相关基因在齐整小核菌中进行功能实验。主要工作和结果如下:(1)建立并优化了齐整小核菌原生质体转化方法,使得齐整小核菌的遗传转化方法基本齐备。在实验室前期已经实现了齐整小核菌的根癌农杆菌介导转化法和电转化法的基础上,本研究进一Augmented biofeedback步地建立了原生质体转化方法。实验确定了使用Vino Taste Pro消化齐整小核菌细胞壁的最佳温度为37℃,酶菌重量比例为2:1,消化时间为5 h。在消化完成后选择过滤条件为四层擦镜纸过滤。实验确定了最佳的原生质体液体再生培养基为CYM培养基+0.6 M硫酸镁,最佳的原生质体固体再生培养基为MGY培养基+1 M蔗糖。在此条件下,本研究中成功进行了齐整小核菌原NN2211分子式生质体电转化。(2)构建了基于Golden Gate技术的齐整小核菌转录单元高效组装系统,为齐整小核菌代谢工程提供了高效高基因容量的质粒构建体系。采用Golden Gate技术,为齐整小核菌构建了一套高效的质粒构建系统,包括2个元件的标准化接口改造质粒,4个转录单元组装骨架质粒,4个用于应用质粒组装的骨架质粒和13个应用质粒组装的辅助质粒。此外,在不减少成功率的情况下减少了价格昂贵的酶的用量,使得单个克隆的构建成本大幅下降。最后,本研究中为齐整小核菌构建了一系列的已标准化接口改造元件质粒,常用的转录单元质粒和硬葡聚糖合成相关基因的质粒,证明了此系统构建质粒的高效性和有效性,为齐整小核菌分子生物学和代谢工程研究提供了具有足够基因容量的质粒构建技术平台。(3)对齐整小核菌硬葡聚糖生物合成预测的相关基因进行了功能实验,并构建了初步的硬葡聚糖代谢工程菌株,得到了与硬葡聚糖合成相关的靶标基因。利用上述质粒组装系统,对于生物信息学预测的硬葡聚糖生物合成途径中的相关基因GME834、GME7171和GME5438进行了基因表达下调(RNAi)的功能测试。结果发现GME834和GME5438基因被沉默时硬葡聚糖的产量显著高于野生型对照。而GME7171基因被沉默时的硬葡聚糖产量与野生型对照没有显著区别。此外,构建了本课题组已经验证的硬葡聚糖合成正相关基因GME4934和GME1658的共同过表达菌株,并进行了硬葡聚糖发酵实验。结果表明共同过表达菌株的硬葡聚糖产量也显著高于野生型对照。综上所述,本研究建立和优化了齐整小核菌原生质体转化方法,并构建了基于Golden Gate技术的齐整小核菌转录单元高效组装系统,从而丰富和完善了齐整小核菌代谢工程遗传操作技术体系。对齐整小核菌硬葡聚糖生物合成的相关基因进行了功能验证,为后续的硬葡聚糖代谢工程提供了靶标基因。这些工作为构建齐整小核菌硬葡聚糖代谢工程菌株提供了强有力的技术支撑,有利于未来实现硬葡聚糖的绿色高效生产。