2020年国际癌症研究机构统计,全球肺癌患者新发病例已有220万,死亡病例高达180万,位居癌症死亡人数第一。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌比例的85%,即使经过手术和放、化疗以及靶向治疗等手段处理后依然会复发,且伴有不同程度的副作用,导致预后不良。因此探索新的靶点和药物仍是治疗NSCLC亟需攻克的难题。目前,细胞自噬是癌症治疗中的研究热点之一,对肿瘤发生进展,转移和治疗抵抗等方面起到至关重要的作用。当细胞面对各种不利因素刺激时,过度自噬可激活细胞死亡程序,引起肿瘤细胞发生自噬性死亡。另外,铁死亡这一新型细胞死亡方式可以在肿瘤模型实验中发挥抗癌效果,其具体抗癌机制获得国内外学者的诸多关注。我国中药资源十分丰富,其中有多种活性成分可调节细胞发生自噬和铁死亡,从而达到抑制肿瘤生长的目的。臭椿酮(ailanthone,AIL)是中药臭椿的有效活性成分之一,已被证明具有显著的抗癌活性,但其对于肺癌的具体治疗机制尚不明确。本研究拟采用体内、体外实验方法,探究AIL对NSCLC细胞的抗肿瘤作用,及其对肿瘤细胞自噬和铁死亡的影响,评价中药单体AIL对肺癌的防治效应。第一部分臭椿酮体外抗肿瘤作用目的:检测AIL对小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)细胞增殖、自噬和铁死亡的影响。方法:1.MTT法检测梯度浓度AIL作用LLC细胞,计算IC_(50)值并确定后续实验浓度。2.光镜下观察0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后的细胞形态变化。3.平板克隆实验检测0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后的细胞克隆形成能力。4.免疫荧光实验检测0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后自噬相关基因P62和LC3B的蛋白表达水平。5.蛋白质印迹法检测0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后自噬相关基因P62、Beclin1、ATG5、LC3B的蛋白表达水平。6.DCFH-DA探针法检测0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后ROS的累积情况。7.比色法检测0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后铁死亡相关指标Fe~(2+)、LPO、MDA、GSH、T-SOD、CAT的表达水平。8.蛋白质印迹法检测0、2.5、5、10μM浓度AIL作用LLC细胞24h后铁死亡相关指标x CT、GPX4、FTH和TFRC的蛋白表达水平。结果:1.AIL抑制LLC细胞活力:AIL可抑制LLC细胞的增殖活力,IC_(50)值为7.696μM,并具有剂量依赖性和时间依赖性。2.AIL对LLC细胞形态学的影响:光镜下观察发现,AIL作用后LLC细胞粘附能力减弱,形态皱缩、大小不均匀、折光能力差,且随着药物浓度增加,细胞形态改变愈加明显。3.AIL抑制LLC细胞克隆形成能力:平板克隆形成实验显示,与0μM对照组相比,随着AIL浓度增加,LLC细胞克隆形成数量明显减少(F=0.680,P<0.001),提示AIL可抑制LLC细胞克隆形成能力。4.免疫荧光法检测显示AIL促进LLC细胞发生自噬:AIL使细胞中LC3B蛋白绿色荧光强度增加(F=152.179,P<0.001),P62蛋白绿色荧光强度降低(F=255.494,P<0.001),并具有剂量依赖性。5.蛋白免疫印迹法检测显示AIL促进LLC细胞自噬:结果显示,随着AIL剂量的增加,细胞内自噬相关蛋白Beclin1(F=456.014,P<0.001)、ATG5(F=247.187,P<0.001)、LC3B(F=152.740,P<0.001)表达均逐渐升高,同时P62(F=1234.348,P<0.001)蛋白表达下降。6.AIL促进LLC细胞内ROS的累积:荧光显微镜观察可见,与0μM对照组相比,AIL作用后细胞内代表ROS水平的绿色荧光信号增多,且随着药物浓度增加,荧光强度越明显(F=182.200,P<0.001)。同样地,多功能酶标仪检测结果也显示,AIL作用引起LLC细胞内荧光水平明显增加(F=15.863,P<0.001)。7.AIL诱导LLC细胞内Fe~(2+)、LPO、MDA水平升高,GSH、T-SOD、CAT水平降低:比色法检测AIL作用LLC细胞24h后,细胞内Fe~(2+)(F=353.507,P<0.001)、LPO(F=380.356,P<0.001)和MDA(F=230.938,P<0.001)浓度明显升高,且随着AIL浓度升高,更进一步提升了细胞内游离的Fe~(2+)、LPO和MDA的浓度。此外,细胞内GSH(F=67.112,P<0.001)、T-SOD(F=74.961,P<0.001)和CAT(F=88.188,P<0.001)含量下降,且随AIL浓度增加,其含量下降更明显,结果提示AIL诱导LLC细胞铁死亡。8.AIL下调x CT蛋白,上调GPX4、FTH、TFRC蛋白的表达水平:蛋白质免疫印迹结果显示,与0μM对照组相比,加入不同剂量的AIL作用后,肺癌细胞内x CT(F=2055.887,P<0.001)、GPX4(F=160.192,P<0.001)、FTH(F=402.311,P<0.001)表达水平明显减少,而TFRC(F=484.205,P<0.001)蛋白表达水平明显增加,且有显著的剂量依赖关系,结果提示AIL能够诱导LLC细胞发生铁死亡。结论:AIL可抑制肺癌LLC细胞活力,促进肺癌细胞发生自噬和铁死亡。第二部分AIL体内抗肿瘤作用研究目的:探讨AIL对肺癌模型小鼠肿瘤细胞增殖、自噬和铁死亡的影响。方法:1.建立Lewis肺癌皮下移植瘤小鼠模型:收集对数生长期LLC细胞,调整细胞密度至5×106个/ml制成单细胞悬液,以每只200μl细胞悬液皮下注射于C57BL/6J小鼠的右后肢股部。建立第一代Lewis肺癌细胞皮下移植瘤小鼠模型。每天观察第一代Lewis肺癌移植瘤模型小鼠状态,待皮下瘤体积达到800mm3时,采用1%戊巴比妥钠腹腔注射,麻醉处死小鼠。无菌剥离瘤块,去除中心颜色变暗及坏死部分,将肿瘤剪成1×1×1mm大小组织块,接种于小鼠右后肢腹股沟部,建立第二代Lewis肺癌皮下移植瘤小鼠模型。每天观察第二代Lewis肺癌移植瘤模型小鼠状态,待瘤块体积达到800mm3时,重复上述肿瘤组织接种步骤,建立第三代Lewis肺癌细胞皮下移植瘤小鼠模型。2.对Lewis肺癌皮下移植瘤模型小鼠进行分组给药:将32只第三代Lewis肺癌皮下移植瘤C57BL/6J小鼠随机分为4组,模型组(Control)、AIL 1mg/kg组、AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组(DDP5mg/kg)。肿瘤接种次日给药,对照组小鼠给予生理盐水,每天给药;AIL组小鼠分别给予1mg/kg、5mg/kg浓度的AIL,每天给药,持续给药14天;阳性对照顺铂组小鼠给予5mg/kg浓度的DDP,每周给药一次,连续给药2周。所有小鼠给药方式均为腹腔注射。3.监测Lewis肺癌皮下移植瘤模型小鼠生理特征:实验期间,每三天称取小鼠体重、游标卡尺测量并计算瘤体体积,监测小鼠整体状态。4.样本收集:第14天给药的24h后,采用1%戊巴比妥钠腹腔注射,麻醉处死小鼠。收集小鼠血清,剥离小鼠肿瘤、主要脏器并称重。将收集的肿瘤组织分为2份:一部分用4%多MK-4827分子式聚甲醛进行固定,待脱水制成石蜡切片备用;其余立即放于液氮备用。5.乌拉坦诱导的肺癌小鼠模型建立、分组及给药:自造模之日起,阴性对照组和模型组小鼠同时给予等体积生理盐水。阳性对照顺铂组按照4mg/kg一周给药一次,持续4周;AIL组小鼠分别腹腔注射1mg/kg和5mg/kg的AIL,按照3天给药1次,持续20周。6.监测乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠的生理体征:实验期间,每2周称取小鼠体重并监测小鼠整体状态。7.样本收集:在最后一次给药的48h后,采用1%戊巴比妥钠腹腔注射,麻醉处死小鼠。收集小鼠血清,剥离小鼠肺脏和其他主要脏器,拍照并计数肺部肿瘤结节数。将收集的肺组织分为2份:一部分用4%多聚甲醛进行固定,待脱水制成石蜡切片备用;其余立即放于液氮备用。8.小鼠主要器官进行HE染色。9.免疫组化法检测小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白P62、LC3B、ATG5、Beclin1的表达水平。10.比色法检测肺癌小鼠血清中Fe2+、LPO、MDA、GSH、T-SOD和CAT的水平。结果:1.AIL对Lewis肺癌移植瘤模型小鼠一般状态的影响:对C57BL/6J小鼠进行皮下移植瘤实验后,阳性对照顺铂组小鼠活动量明显减少;其他组小鼠精神状态尚可。实验过程中,不同处理组小鼠体重无明显差异。2.AIL抑制Lewis肺癌移植瘤模型小鼠肿瘤生长:与模型组相比,AIL 1mg/kg组,AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组可显著抑制小鼠肿瘤细胞生长。其中1mg/kg和5mg/kg的AIL对LLC细胞所形成的小鼠肿瘤体积(F=35.099,P<0.001)和重量(F=25.639,P<0.001)具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。3.AIL促进Lewis肺癌移植瘤模型小鼠肿瘤细胞发生自噬:小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白P62(F=951.235,P<0.001)、Beclin1(F=97.252,P<0.001)、ATG5(F=1282.965,P<0.001)、LC3B(F=88.430,P<0.001)在模型组、AIL 1mg/kg组、AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组之间均存在显著性差异。与模型组相比,AIL(1mg/kg和5mg/kg)处理后的小鼠肿瘤组织中P62(P<0.001)蛋白表达下降,而Beclin1(P<0.001)、ATG5(P<0.001)、LC3B(P<0.001)表达均升高,且具有剂量依赖性。4.在Lewis肺癌移植瘤模型小鼠中,AIL诱导铁死亡:小鼠血清中Fe2+(F=181.330,P<0.001)、LPO(F=58.238,P<0.001)、MDA(F=145.838,P<0.001),以及具有清除ROS功能的抗氧化酶GSH(F=48.670,P<0.001)、T-SOD(F=52.604,P<0.001)和CAT(F=120.710,P<0.001)水平在模型组、AIL 1mg/kg组、AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组之间均存在显著性差异。与模型组相比,AIL(1mg/kg和5mg/kg)处理后小鼠血清中的Fe2+(P<0.001)、LPO(P<0.05)和MDA(P<0.001)浓度明显升高,而GSH(P<0.05)、T-SOD(P<0.05)和CAT(P<0.05)的含量明显降低,且具有剂量依赖性。5.AIL对Lewis肺癌移植瘤小鼠主要脏器的影响:取出荷瘤小鼠主要脏器,并进行称量和HE染色。与对照组相比,阳性对照顺铂组小鼠肝脏(F=17.224,P=0.001)脏器系数增高。其他各组间比较均无统计学意义Belumosudil半抑制浓度。HE染色镜下观察无明显病变。6.AIL对乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠一般状态的影响:通过定期观察发现,对照组生存状态良好;AIL 1mg/kg组和AIL5mg/kg组小鼠精神状态和活动量尚可;而模型组和阳性对照顺铂组小鼠表现出活动量减少、对食物欲望降低、嗜睡以及对外界刺激反应较差等现象;阳性对照顺铂组小鼠精神状态不佳的表现尤为明显。与用药前相比,对照组小鼠在前10周体重稳步增长(P=0.003),后期体重趋于稳定(P=0.158);模型组小鼠前5周体重下降(P=0.002),后期停药后体重恢复(P=0.223);阳性对照顺铂组在前10周造模并给予药物治疗的同时,小鼠体重明显下降(P=0.007),停止乌拉坦和顺铂注射后,体重逐渐恢复至正常(P=0.057);AIL 1mg/kgmicrobiota assessment组和AIL 5mg/kg组小鼠1~10周整体体重趋于稳定(P>0.05),后期AIL 1mg/kg组(P=0.022)和AIL 5mg/kg组(P<0.001)小鼠体重均呈上升趋势。7.AIL可降低乌拉坦诱导肺癌模型小鼠的肺癌发生率和肺部肿瘤结节数:AIL 1mg/kg组,AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组小鼠肺癌发生率和肺部肿瘤结节数均低于模型组(P<0.05);且与AIL 1mg/kg相比,5mg/kg的AIL更能降低小鼠肺癌发生率(P<0.001)和肺肿瘤结节数(P=0.031),差异具有统计学意义。8.AIL促进乌拉坦诱导肺癌模型小鼠的肺部肿瘤细胞发生自噬:小鼠肺部肿瘤组织中自噬相关蛋白P62(F=96.019,P<0.001)、LC3B(F=284.211,P<0.001)、ATG5(F=669.711,P<0.001)、Belcin1(F=815.193,P<0.001)在阴性对照组、模型组、AIL 1mg/kg组、AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组之间均存在显著性差异。与模型组相比,P62蛋白在AIL1mg/kg组(P=0.016)和AIL 5mg/kg组(P<0.001)的小鼠肿瘤组织中表达下降,而LC3B(P<0.001)、ATG5(P<0.001)、Beclin1(P<0.001)蛋白表达均升高,且具有剂量依赖性。9.在乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠体内,AIL诱导铁死亡:比色法检测小鼠体内血清铁离子和脂质过氧化物等水平,Fe2+(F=43.677,P<0.001)、LPO(F=53.223,P<0.001)、MDA(F=286.015,P<0.001),以及具有清除ROS功能的抗氧化酶GSH(F=690.885,P<0.001)、T-SOD(F=1211.322,P<0.001)和CAT(F=16.227,P<0.001)水平在阴性对照组、模型组、AIL 1mg/kg组、AIL 5mg/kg组和阳性对照顺铂组之间均存在显著性差异。与模型组相比,AIL处理后小鼠血清中的Fe2+(P<0.001)、LPO(P<0.05)和MDA(P<0.001)浓度明显升高;而GSH(P<0.05)、T-SOD(P<0.001)和CAT(P<0.05)的含量降低,且具有剂量依赖性。10.AIL对乌拉坦诱导肺癌模型小鼠主要脏器的影响:与模型组相比,阳性对照顺铂组小鼠肝脏脏器系数增高,并具有显著性差异(F=3.642,P=0.044);其他各组间比较均无统计学差异。HE染色镜下观察均无明显病变。结论:在Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型和乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型中,AIL可有效抑制肿瘤生长,并引起肿瘤细胞发生自噬和铁死亡。