草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属多年生草本植物,果实富含大量类黄酮物质,在未成熟的草莓果实中,主要是原花青素(Proanthocyanidins,PAs),随着草莓果实的成熟变红,花青素苷(Anthocyanins)的含量逐渐上升。在植物生长发育过程中,类黄酮物质能帮助植物抵御外界环境的胁迫,同时,作为药用、保健和营养成分在人类健康中扮演重要角色。因此,提高草莓果实类黄酮物质的含量一直是草莓育种工作者追求的目标。植物类黄酮的合成和积累涉及复杂的调控网络,其中MYB转录因子起着核心作用。目前,对蔷薇科的研究主要集中在MYB10及其等位基因,对其它MYB以及参与该过程的MYB-b HLH-WD40(MBW)复合体知之甚少。本研究以栽培草莓‘红颜’、‘小白’、‘丰香’、‘白雪公主’以及本氏烟草为材料,利用生物信息学分析、瞬时过表达、Y2H、BiFC、双荧光素酶系统、EMSA、Western blot、转录组测序以及代谢组检测等技术手段,探讨了MYB,b HLH和WD40转录因子及其形成的MBW复合体对草莓果实类黄酮代谢的调控机制。主要研究结果如下:1.从栽培草莓中筛选并克隆得到15个候选MBW成员:6个MYB(FaMYB1/9/10/11、R3-FaMYB5和R2R3-FaMYB5)、6个b HLH(FaEGL3、Fab HLH33/33B/3、FaMYC1和FaGL3)以及3个WD40(FaTTG1、FaLWD1和FaLWD1-like)。其中包含一个全新的、具有完整R2R3结构域的FaMYB5转录因子。进一步对这些转录因子在‘红颜’和‘小白’果实不同发育时期的表达模式进行分析,发现它们在果实的各个发育时期均有表达。其中Faoncologic outcomeMYB1的表达量随着‘小白’果实的转色逐渐升高,R2R3-FaMYB5在果实各个时期稳定表达,而FaMYB10具有明显的组织特异性,集中在果实成熟后期表达,FaMYB9/11则主要在绿果中表达。2.在草莓果实中对这15个转录因子进行瞬时过表达,发现R2R3-FaMYB5,FaMYB9/10/11通过促进‘小白’果肉Cy3G和Pg3G的积累,恢复‘红颜’果肉Cy3G的积累,显著提升草莓果实花青素苷的含量。此外,上述过表达样品中PAs的含量也被显著上调。3.Y2H和BiFC试验证实R2R3-FaMYB5/10、FaEGL3、FaLWD1/FaLWD1-like蛋白两两互作,并GSK126且形成MBW复合体调控草莓果实类黄酮代谢。R2R3-FaMYB5/10+FaEGL3、R2R3-FaMYB5/10+FaEGL3+FaLWD1、R2R3-FaMYB5/10+FaEGL3+FaLWD1-like复合体对果实花青素苷、PAs以及代谢通路上结构基因的调控强度优于单独的复合体成员。4.FaMYB10及其主导的复合体对类黄酮的正调控作用是通过上调代谢通路上几乎所有结构基因的表达(除了LAR)实现的,相比之下,R2R3-FaMYB5的调控范围较为特异,只有PAL,LAR,TT12,AHA10,C4H,F3’H和LAR能够被其影响。这两个MYB对花青素苷的促进主要通过大幅上调C4H和F3’H的表达。对于PAs的积累,R2R3-FaMYB5通过调控LAR支路,而FaMYB10则通过调控ANR支路,值得注意的是,FaMYB9和FaMYB11能同时上调LAR和ANR的表达,进而大幅促进PAs的积累。5.对R2R3-FaMYB5‘小白’过表达样品进行RNA-seq和代谢组分析。基于RNA-seq数据,筛选到6896个差异表达的m RNA,489个差异表达的lnc RNA,37个差异表达的circ RNA和12差异表达的micro RNA。与q PCR结果一致,大多数类黄酮代谢合成基因,包括早期、晚期结构基因以及转运基因的表达量都被提高,其中C4H、F3’H和LAR的增幅最大。双荧光素酶分析显示R2R3-FaMYB5能激活F3’H和LAR的启动子。进一步采用EMSA证实R2R3-FaMYB5直接结合F3’H启动子上的MYB结合位点(AACCTAA),以及LAR启动子上的MYB结合位点(ACCAACAACCAAA)。此外,差异表达lnc RNA TCONS＿00102355和TCONS＿00090344被预测为能调控R2R3-FaMYB5的转录水平。代3-Methyladenine试剂谢组结果表明过表达R2R3-FaMYB5不仅提高了草莓中常见的花青素苷含量,多个类黄酮化合物如槲皮素糖苷、染料木苷等均被上调。此外,木质素生物合成的中间代谢物:咖啡酸、香豆醛等,均明显增加。6.在myb10突变体‘白雪公主’中过表达R2R3-FaMYB5,不能恢复果肉中花青素苷的积累。q PCR和RNA-seq结果表明,R2R3-FaMYB5虽显著促进大多数参与花青素苷代谢的结构基因,包括PAL、C4H、F3’H和LAR。但是,与FaMYB10相比,R2R3-FaMYB5不能促进花青素苷转运因子TT19的表达。在‘白雪公主’中共表达R2R3-FaMYB5和FaTT19,果实恢复部分色素积累。7.LncRNA-myb5通过正反馈调节R2R3-FaMYB5的转录水平来影响花青素苷和PAs代谢;FaMYB1通过削弱R2R3-FaMYB5对F3’H和LAR启动子的激活强度,在一定程度上抑制R2R3-FaMYB5对花青素苷代谢的促进作用;FaMYB44-like将代谢流由苯丙烷途径导向木质素支路,抵消R2R3-FaMYB5对花青素苷的正调控作用;FaBT2与R2R3-FaMYB5蛋白-蛋白互作,介导R2R3-FaMYB5通过26S蛋白酶体途径泛素化降解。