目的:心肌缺血再灌注(Ischemia Reperfusion,I/R)损伤过程中,多种因素参与最终心肌梗死的过程,其中钙超载是致细胞死亡的重要原因之一。目前心肌I/R过程中L-型钙通道(L-type Voltage-dependent Calcium Channel,LLaduviglusib作用-VDCC)参与钙超载形成已被普遍认可,但是通道功能改变的内在机制目前尚未研究清楚。因此本研究旨在证实心肌I/R可以导致L-VDCC活性改变,探讨心肌I/R导致的L-VDCC活性改变是否与通道自抑制功能减弱有关。方法:1.大鼠离体心脏功能检测:30只SD大鼠随机分为3组,每组10只,分别为Ischemia 0min组(缺血0min组,即持续灌注100min)、Ischemia 30min组(缺血30min组)和Ischemia 60min组(缺血60min组),每组均复灌30min。将大鼠离体心脏悬挂于Langendorff灌流系统模拟缺血-再灌注,采用BL-420N生物信号采集与分析系统监测心脏状态,记录心脏收缩力及心脏表面心电图。2.急性分离大鼠心肌细胞及分组处理:将采用Langendorff离体心脏灌流系统分离得到的含有大鼠心肌细胞的细胞悬液均分为以下3组,Hypoxia 0h组(缺氧0h组,即正常培养24h)、Hypoxia 6h组(缺氧6h组)、Hypoxia 12h组(缺氧12h组),每组均复氧12h。用Co Cl_2处理急性分离的大鼠心肌细胞来构建体外缺氧-复氧模型。3.各组检测指标及方法:采用膜片钳技术检测大鼠心肌细胞I_(Ca-L)变化;在显微镜下计数心肌细胞存活率;Co-IP检测Cav1.2结合DCT、Ca M量的变化及t-selleckchem BMN 673Cav1.2的表达水平;Western Blot检测p-Cav1.2、PKA、PKG、Ca MKⅡ及Calpain-1的蛋白表达水平。4.统计方法:使用SPSS 21.0和Graph Pad 8.0进行统计分析和作Angioedema hereditário图。实验数据以mean±SEM表示,对于符合正态分布和方差齐性的计量资料,多组比较采用单因素方差分析,不符合正态分布和方差齐性采用Kruskal-Wallis检验,P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.随着心肌缺血时间的延长,复灌后心脏收缩力逐渐降低,心肌电活动逐渐减弱大鼠离体心脏功能监测显示,Ischemia 0min组、Ischemia 30min组和Ischemia60min组缺血期及复灌期心脏收缩力(g)及心电图R波峰值(m V)相比于平衡期均显著降低(P<0.01),复灌期比缺血期显著升高(P<0.01);Ischemia 30min组和Ischemia 60min组复灌期的心脏收缩力和R波峰值相比于Ischemia 0min组显著降低(P<0.05),且Ischemia 60min组更明显(P<0.01)。2.心肌缺血再灌注会促进心肌细胞L-VDCC激活,导致I_(Ca-L)增强,并且随着缺氧时间的延长,细胞死亡率逐渐增加膜片钳检测心肌细胞I_(Ca-L)发现,与Hypoxia 0h组相比,Hypoxia 6h组和Hypoxia12h组L-VDCC电流-电压曲线(I-V曲线)峰值逐渐增大,且Hypoxia 12h组峰值升高更显著(P<0.01),同时稳态激活曲线逐渐向左偏移,通道半激活电压(V_(1/2))逐渐增加,Hypoxia 6h组稳态激活曲线的K_a值无明显变化(P>0.05),而Hypoxia12h组明显降低(P<0.01)。显微镜下细胞计数结果显示:与Hypoxia 0h组相比,随着缺血时间的延长,Hypoxia 6h组和Hypoxia 12h组心肌细胞存活率显著降低(P<0.01)。3.随着心肌细胞缺氧时间延长,Calpain-1的表达量降低,Cav1.2结合DCT及CaM的量逐渐减少WB检测Calpain-1的表达水平,发现与Hypoxia 0h组相比,Hypoxia 6h组和Hypoxia 12h组Calpain-1的表达量下降(P<0.05),且Hypoxia 12h组下调更明显(P<0.01)。同时,Co-IP的结果显示Hypoxia 6h组和Hypoxia 12h组Cav1.2结合DCT、Ca M的量相较于Hypoxia 0h组显著下调(P<0.05);Hypoxia 12h组Cav1.2结合DCT、Ca M的量与Hypoxia 6h组比较无明显差异(P>0.05);各组t-Cav1.2表达量无明显变化(P>0.05)。4.在心肌细胞缺氧-复氧过程中,外源性调节蛋白的表达水平无明显变化WB检测结果显示,Hypoxia 6h组和Hypoxia 12h组p-Cav1.2、PKA、PKG表达水平与Hypoxia 0h组相比无明显变化(P>0.05),Ca MKⅡ表达水平显著升高(P<0.01);Hypoxia 6h组和Hypoxia 12h组相比,各蛋白表达量无明显差异。结论:心肌缺血再灌注损伤可引起心肌细胞L-VDCC自抑制功能减弱,Ca~(2+)内流增加,引起细胞钙超载,从而加速心肌细胞死亡。