背景和目的:根据国际糖尿病联合会(IDF)统计,约有4.63亿成年人患糖尿病,预计到2045年,全球糖尿病总人数将达到7亿~([1])。因此,进一步开发糖尿病防治靶点显得尤为重要。Ⅰ型糖尿病是由T细胞介导的胰岛β细胞破坏,导致胰岛素绝对缺乏所致的自身免疫性疾病。II型糖尿病是由遗传因素和不良代谢环境导致的进行性胰岛β细胞损伤。目前,移植供体严重短缺和免疫排斥反应等是糖尿病临床治疗面临的瓶颈问题。为了解决上述问题,人们从干细胞治疗、免疫治疗、体外生成胰岛素样细胞治疗和纳米材料治疗等多方面进行了探索,以期寻找到有效的胰岛β细胞替代方案。比如:移植大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化产生的胰岛素样细胞(insulin-producing cells,IPCs)在改善血糖和恢复残存胰岛细胞功能方面显示出一定的效果,表明移植干细胞来源IPCs对于糖尿病的治疗具有较好的应用前景。为了获得具有免疫抑制功能且稳定表达胰岛素的IPCs,克服糖尿病免疫介导的胰岛细胞破坏,人们尝试了多种免疫抑制疗法,但均未取得理想的治疗效果。而静电纺丝纤维作为纳米级支架能够有效的模拟细胞外基质环境,为细胞的粘附、生长和分化提供必要载体。课题组前期工作发现负载Zn T8_((107-115))和HLA-A2多肽二聚体的聚多巴胺改性明胶聚乳酸静电纺丝纤维复合材料(PLLA/G-p DA-p MHC)能通过释放二聚体诱导免疫耐受和促进干细胞分化,为细胞的生长构造独立的排列空间,在诱导细胞表型转换和增加细胞数量方面具有显著优势。PLLA/G-p DA-p MHC被认为可能通过调节免疫和促进干细胞分化实现双重功能。目前研究表明,糖尿病高糖(high glucose,HG)环境中IPCs细胞存活率低成为阻碍其发展的重大挑战。移植后细胞死亡可能是限制IPCs移植治疗效果的主要因素。虽然,已有实验认为IPCs移植后发生的细胞凋亡可能与IPCs治疗失败有关,但利用特异性凋亡抑制剂等措施并未见完全改善移植后的细胞死亡现象,提示可能还存在着其他形式的程序性细胞死亡。我们查阅相关文献发现一种新形式调节性细胞死亡机制,铁死亡可能是HG环境诱导胰岛β细胞死亡的主要途径之一,在糖尿病及相关并发症中发挥着重要作用。虽然,有研究发现铁死亡在糖尿病胰岛β细胞死亡过程中发挥重要调控作用,但关于铁死亡对移植后IPCs损伤的调控作用及机制却鲜有报道。鉴于铁死亡机制的复杂性,需要利用生物信息学方法更为全面的分析铁死亡相关信号通路与移植后IPCs损伤的关系。在生理水平上,细胞内可变铁池稳态在细胞代谢、增殖和死亡过程中发挥至关重要的调控作用。由于可变铁池内的铁离子催化活性不受限制,其浓度的增加所引发的氧化作用能够直接损伤DNA、蛋白质和脂质,进而导致细胞死亡。研究认为NCOA4介导的铁蛋白自噬是细胞维持可变铁池稳态的重要途径,NCOA4在细胞可变铁池浓度过低的情况下可与铁蛋白结合,并递送至自噬溶酶体降解以向胞浆释放铁离子;而当细胞中可变铁池水平过高时,NCOA4选择性的与HERC2结合被泛素化及降解,从而降低铁蛋白自噬的活性。提示从NCOA4入手有望为阐明HG环境中铁蛋白自噬介导的可变铁池失衡诱导干细胞来源IPCs的死亡机制提供新思路。综上,本研究以PLLA/G-p DA-p MHC支架为基础构建BMSCs向IPCs分化的培养体系,获得具有免疫抑制功能且稳定分泌和表达胰岛素的IPMedical errorCs,进一步通过HG培养液模拟糖尿病高血糖环境,结合生物信息学分析方法,阐明HG环境诱导IPCs的损伤机制,旨在为降低干细胞来源IPCs移植后的细胞死亡率,提高IPCs细胞治疗效果提供新靶点。研究方法:1.IPCs细胞分化体系的构建(1)为了构建具有免疫耐受功能的IPCs细胞分化体系,对PLLA/G-p DA-p MHC支架进行改性和理化性质测试:FTIR测定化学组成、结构及形貌、接触角测量仪及含水量分析检测亲水性;利用ELISpot检测分化体系对CD8~+T细胞IFN-γ分泌能力的影响;CCK-8实验检测淋巴细胞增殖能力变化;LDH释放实验检测淋巴细胞对靶细胞的特异性杀伤效应。(2)为了获得具有免疫抑制功能且稳定分泌和表达胰岛素的IPCs,分离提取大鼠BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标志分子表达;扫描电子显微镜观察BMSCs在PLLA/G-p DA-p MHC支架上的生长状态;以PLLA/G-p DA-p MHC支架为基础构建BMSCs向IPCs分化的培养体系,利用Western blot和q PCR实验检测IPCs细胞Pdx-1、Glut-2、Insulin、Pax-4的m RNA和INSULIN蛋白表达水平变化;ELISA法检测胰岛素分泌情况。2.HG诱导IPCs铁死亡机制的研究(1)利用生物学信息方法对GEO数据库中移植前与移植后60-120天胰岛细胞的基因表达进行对比分析;对差异表达基因进行KEGG信号通路富寻找更多集分析;通过蛋白质-蛋白质相互作用及基因相关性分析铁死亡相关信号通路差异表达基因之间的相互作用关系及相关性系数,初步确定铁死亡与移植后胰岛细胞损伤的相关性。(2)为了确定铁死亡是HG环境下IPCs细胞死亡的主要途径,采用含25m M葡萄糖培养液培养IPCs,模拟体内高血糖环境;采用铁死亡抑制剂(Ferrostatin1,Fer-1)、坏死性凋亡抑制剂(Necrostatin1,Nec-1)、凋亡抑制剂(Z-VAD)对IPCs进行预处理,CCK-8方法检测细胞活力变化。(3)为了明确HG环境通过上调可变铁池浓度诱导IPCs铁死亡,采用铁离子螯合剂去铁胺(deferoxamine,DFO)预处理IPCs;利用CCK-8法检测细胞活力变化;流式细胞术检测IPCs细胞脂质过氧化水平;流式细胞仪检测细胞内可变铁池浓度变化;q PCR和Western blot检测铁死亡标志分子GPX4和XCT的m RNA水平和蛋白水平变化;MDA检测试剂盒检测细胞MDA水平变化。(4)为了阐明HG环境通过上调细胞铁蛋白自噬水平提高IPCs可变铁池浓度,采用自噬抑制剂(chloroquine,CQ)预处理IPCs,流式细胞仪检测细胞内可变铁池浓度变化;Western blot检测铁死亡和自噬标志分子LC3、p62、TFRC和Ferritin的蛋白表达水平变化;MDA检测试剂盒检测细胞内MDA水平变化。(5)为了进一步明确HG环境通过NCOA4介导的铁蛋白自噬提高可变铁池浓度,采用sh RNA和过表达质粒在IPCs中敲低NCOA4和过表达NCOA4,Western blot检测NCOA4的敲低和过表达效率,以及在HG环境下敲低和过表达NCOA4对Ferritin蛋白表达的影响;通过流式细胞仪检测可变铁池浓度变化和脂质过氧化水平变化。(6)为了确定HG环境下NCOA4对IPCs胰岛素合成和分泌的影响,在敲低和过表达NCOA4的前提下,Western blot检测HG环境下胰岛素蛋白表达水平,并通过ELISA法检测培养上清中胰岛素分泌水平变化。实验结果:1.FTIR结果显示Zn T8_((107-115))/HLA-A2多肽二聚体被负载于PLLA/G-p DA支架,表明PLLA/G-p DA-p MHC构建成功,且具有更高效的亲水性。免疫学检测发现PLLA/G-p DA-p MHC支架能够显著抑制CD8~+T细胞IFN-γ的分泌、淋巴细胞增殖以及淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应。表明成功构建具有免疫抑制功能的PLLA/G-p DA-p MHC支架材料。2.流式细胞检测显示分离培养的BMSCs中CD29、CD44、CD90和CD105表达阳性,而CD34和CD45表达阴性,表明分离纯化BMSCs具有正常的表面特异性标记;扫描电子显微镜观察和CCK-8活力分析发现PLLA/G-p DA-p MHC支架具有更好的生物相容性;q PCR结果显示PLLA/G-p DA-p MHC支架构建的分化体系能够促进IPCs中Pax-4、Pdx-1、Glut-2和Insulin m RNA表达,同时促进INSULIN蛋白表达;与对照组IPCs比较,PLLA/G-p DA-p MHC支架能够更显著的促进IPCs分泌胰岛素。表明PLLA/G-p DA-p MHC支架能够更有效的促进BMSCs向IPCs分化。3.KEGG信号通路富集分析发现移植前后胰岛细胞差异表达基因主要富集在铁死亡、谷胱甘肽代谢、自噬等信号通路;PPI和相关性分析发现上述通路差异表达基因存在显著的相互作用及相关性,尤其NCOA4与自噬相关基因Atg7、Ulk2、gd、Nfe2l2等具有显著的相关性。初步表明铁死亡可能在移植后胰岛细胞损伤过程中发挥重要的调控作用。4.流式细胞术检测发现,HG处理的IPCs细胞内可变铁池浓度和脂质过氧化水平呈时间依赖性显著增加;q PCR和Western blot结果表明HG处理后的IPCs细胞铁死亡标志分子GPX4和XCT在转录和蛋白水平表达均下调;细胞内MDA水平显著升高;铁离子螯合剂(DFO)能够显著逆转上述现象;与其他处理组比较,铁死亡抑制剂(Fer-1)预处理能够有效降低HG环境对IPCs的损伤作用。进一步明确铁死亡是HG环境诱导IPCs损伤的主要途径。5.Western blot结果显示HG处理后IPCs内TFRC和p62的蛋白表达水平呈时间依赖性降低,而Ferritin和LC3蛋白表达水平呈时间依赖性升高;自噬抑制剂氯喹(CQ)能够逆转HG介导的TFRC蛋白表达下调和Ferritin蛋白表达的上调;流式细胞仪检测结果和MDA检测结果发现CQ能够逆转HG诱导的可变铁池浓度和MDA水平的升高。表明HG处理是通过激活铁蛋白自噬诱导IPCs铁死亡。6.Western blot结果显示HG处理后NCOA4蛋白表达水平显著升高,敲低或过表达NCOA4能够抑制或促进HG介导的Ferritin蛋白降解;同时,敲低NCOA4增强HG诱导的脂质过氧化水平升高。表明NCOA4是HG环境下调控IPCs铁蛋白自噬的关键分子。7.Western blot和ELISA检测结果显示敲低NCOA4能够逆转HG环境介导的胰岛素合成和分泌的降低,而过表达NCOA4加重胰岛素合成和分泌的降低;同时,抑制铁死亡能够恢复IPCs胰岛素的分泌;q PCR检测发现敲低NCOA4或过表达NCOA4能够抑制或促进HG诱导的Pdx-1 m RNA水平的降低。表明NCOA4通过调控铁蛋白自噬影响HG环境下IPCs的成熟。结论:1.利用PLLA/G-p DA-p MHC支架促进了BMSCs分化成为具有免疫抑制功能且稳定表达和分泌胰岛素的IPCs。2购买Crizotinib.铁死亡是调控HG环境中IPCs细胞存活率下降的主要途径。3.NCOA4介导的铁蛋白自噬参与调控了HG环境诱导的IPCs铁死亡过程。4.抑制NCOA4通路有望成为预防IPCs细胞损伤、防治糖尿病的重要靶点。