癌症是全球的主要死亡原因之一,严重危害人类生命健康,制约社会经济发展。当前癌症发病率和死亡率正在迅速增长,探究新的致癌机制、开发新的治疗方式和药物成为当务之急。液液相分离(LLPS)驱动无膜区室的形成,是细胞分隔区间的重要方式之一,参与调节细胞的各种生命活动,已有越来越多的研究表明LLPS与癌症有关。半数以上的癌症中存在肿瘤抑制因子p53的突变,使其在癌症领域极为重要,一直是研究热点。最近研究发现p53在体外特定的条件下发生LLPS,但p53相分离的分子机制、生理功能及其与癌症的关系尚未明确,有待探究。Annexins家族的成员Annexin A1是癌症潜在的诊断标记和治疗靶点,受到人们的广泛关注。已有研究发现Ca~(2+)诱导下,Annexin A1在细胞表面形成微米级颗粒,且具有可逆性,与相分离形成的液滴性质类似,表明Annexin A1有发生LLPS的可能性。本论文对p53和Annexin A1相分离的分子机制和生理功能进行研究,探究它们的相分离和癌症的关系,主要研究内容如下:(1)p53体外相分离的分子机制研究。构建相关原核表达质粒,并纯化出带有绿色荧光标签的重组蛋白p53-FL(p53全长)、片段p53-UBR、p53-△UBR(切除UBR的片段)以及p53-UBR突变型R337H、R337C、R337P、L344P。通过浊度实验、荧光成像、荧光漂白恢复实验首次确定UBR是p53相分离的关键区域,UBR发生LLPS驱动力为静电和疏水相互作用。对比野生型UBR与其四聚体区(TD)致癌突变的相分离行为和寡聚状态,发现TD的致癌突变通过阻止四聚体的形成抑制p53的相分离,为研究细胞内层面p53相分离及功能奠定基础。(2)p53细胞内相分离的表征及其功能研究。构建p53-FL及其TD致癌突变R337H、R337C、R337P和L344P的真核表达质粒,将上述质粒转RAD001采购染到经典肿瘤模型He La细胞和不表达p53的H1299细胞内,以表达蛋白。使用Dox模拟细胞内DNA损伤,通过共聚焦成像、FRAP实验和压力去除实验发现细胞内p53发生相分离,且TD致癌突变抑制p53相分离,与体外结果一致。免疫荧光实验显示Ser15磷酸化p53与p53相分离形成的凝聚物高度共定位,表明p53相分离与p53的激活密切相关。此外,致癌突变体R337C、R337P和L344P显著减弱p53下游基因p21的表达量,提高细胞存活率。我们揭示了p53相分离的生理功能及其与癌症关系:TD致癌突变抑制p53相分离,减弱p53激活,进而降低p53下游靶基因的表达,导致癌症发生和发展。(3)Annexin A1(ANXA1)相分离的分子机制及其促进信号转导的研究。我们表达纯化出带有绿色荧光标签的重组蛋白ANXA1-FL和ANXA1-CTD,通过共聚焦观察和FRAP实验,发现在体外溶液、细胞表面和人工膜表面三个层面Ca~(2+)均介导ANXA1的相分离,N端是ANXA1相分离的核心区域,且ANXA1相分离由静电和疏水相互作用驱动。进一步我们发现ANXA1的相分离与ANXA1-FPR1复合物相关,增强FPR1信号通路下游ERK磷酸化活力,促进癌细胞迁徙。本章研究结果表明ANXA1相分离与其致癌机制有关:ANXA1在癌细胞表面发生液液相分离,并参与外膜ANXA1-FRR1复合物的形成,调控癌细胞内的信号通路,从而促进癌症。综上所述,本论文确定UBR是p53相分离的关键区域,TD的致癌突变抑制p53的相分离,以此为基础推测更多出p53致癌的新机制;确定N端是ANXA1相分离的核心区域,并发现ANXA1的相分离参与ANXA1-FRR1复合物形成,将ANXA1相分ER biogenesis离与信号转导关联,阐释了一种ANXA1的致癌机制。本论文进一步揭示了p53和ANXA1与癌症发生的关系,拓宽癌症与相分离研究领域,为p53和ANXA1相关癌症的治疗和药物开发提供新思路。