研究背景与目的:早期肝脏发育和肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)发生中的共同特征是肝细胞快速增殖,阐明肝细胞增殖在发育过程中的调控机制有助于研究HCC的发生。尽管许多基因在肝脏发育早期参与了肝脏长大,但其机制还未被阐明。本研究发现,斑马鱼的肝脏从2dpf(day post fertilization,dpf)到5dpf快速长大。转录组分析显示,在不同阶段的肝细胞中,3dpf的肝脏中有813个肝细胞富集基因。其中,腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase proenzyme,AMD1)参与肝脏发育的机制未见报道。AMD1是多胺合成重要酶之一,而多胺是一种低分子量的简单脂肪胺,几乎存在于所有生物体中。多胺在哺乳动物中对于蛋白质及核酸的合成、抗氧化损伤、离子通道活性、细胞增殖、分化及凋亡中起着重要作用。有研究显示,amd1参与肝癌发生的调控,但其具体机制远未被阐明;在肝脏发育过程中,amd1是否参与肝脏的长大不得而知,所以我们以斑马鱼为模式动物意在揭示amd1在肝脏长大中的作用及分子调控机制及是否参与肝癌发生的调控,并探究肝脏长大与肝癌发生机制的异同。材料与方法:本研究以斑马鱼为模式动物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼amd1突变体,构建Tg(fabp10:GFP)转基因鱼模型观察斑马鱼肝脏发育情况,运用整胚原位杂交技术分析amd1在野生型和突变体中的表达,结合免疫荧光等实验技术观察amd1突变体中肝脏长大是否收到影响。运用RNA-Sequence深度测序技术分析amd1影响肝脏发育的分子机制,通过原位杂交实验及荧光定量PCR确定下游具体的调控信号分子,并利用斑马鱼Kras~(G12V)肝癌模型,研究amd1在肝癌发生中的作用。最后使用药物处理及原位杂交等实验技术探究amd1在肝脏发育及肝癌发生之间分子机制的异同。结果:1.在肝脏快速长大过程中,amd1在肝细胞中高度表达利用Tg(fabp10:GFP)的转基因胚胎分离72小时、第7天及成鱼肝脏的肝细胞并进行RNA-Sequence测序分析,发现813个基因在3dpf肝细胞中高度表达,amd1是其中之一。amd1在3dpf肝细胞中的表达高于成年肝细胞,在7dpf肝细胞中表达下降,可能是肝脏长大控制的候选基因。2.amd1在斑马鱼早期发育中的详细表达模式原位杂交数据显示,amd1为母源性因子,24hpf以前普遍表达,24hpf后,amd1主要局限表达在头部及内胚层细胞。重要的是,amd1在3dpf和4dpf肝脏区域高表达。3.amd1突变体的构建使用CRISPR/Cas9技术构建amd1突变体,在F1成年斑马鱼中,我们筛选出了两种有用的突变体:突变1中碱基“CCCG”改为“TT”,这种编辑导致CDs区168bp处出现终止密码子(我们将其命名为amd1~(168));突变体SB2035802中,7个碱基“CGGCAGG”被删除,CDS区141bp处出现了终止密码子(我们将其命名为amd1~7)。4.在amd1突变体中肝脏长大受抑通过Tg(fabp10:GFP)的转基因背景的胚胎以及原位杂交实验发现,从3dpf到5dpf,amd1~(7-/-)胚胎肝脏体积小于对照组。细胞增殖及凋亡实验表明,在amd1~(7-/-)胚胎中肝细胞增殖大幅下降,而肝细胞凋亡未显著增加。该结果表明,在肝脏长大过程中,肝细胞增殖需要amd1。5.在amd1~(7-/-)胚胎中skp2表达下降利用RNA-Sequence分析amd1~(7-/-)胚胎在4dpf被干扰时的基因发现,在下调的基因中,有4个基因位于m TOR信号通路中,包括skp2。荧光定量PCR实验发现,skp2及其下游基因表达均下调。原位杂交实验显示,skp2在amd1~(7-/-)胚胎中的表达显著下调,包括在肝脏中的表达。6.skp2在肝脏发育中起关键作用,并介导amd1调节肝脏长大原位杂交实验显示,skp2为母系表达基因,在24hpf前普遍表达,24hpf后局限于肝脏、肠道、眼、后脑及中脑边界。利用CRISPR/Cas9技术产生skp2嵌合体突变胚胎,发现skp2表达下调后,早期胚胎发育和肝脏长大受到抑制。在Tg(fabp10:GFP)转基因胚胎和野生型胚胎中,使用skp2抑制剂SMIP004在肝脏快速长大过程处理胚胎,发现在4dpf时肝脏体积变小。此外,细胞增殖实验表明,skp2抑制降低了肝细胞增殖,过表达skp2 m RNA恢复了肝脏大小。7.skp2介导amd1调节斑马鱼HCC模型中的肝细胞增殖使用流式细胞仪从正常肝脏和肝癌模型中分选GFP标记的肝细胞,分析amd1及skp2的表达,荧光定量PCR显示amd1和skp2在HCC模型中表达均上调。在肝癌模型中,amd1的功能丧失降低了肝脏的大小及肝细胞的增殖,使用SMIP00KD025纯度4阻断skp2后,amd1~(7-/-)胚胎中肝脏体积减小,肝细胞增殖水平下降。结论:本研究系统地鉴定了一些可能参与斑马鱼发育过程中肝脏长大的未表征基因,并揭示了amd1-skp2轴在肝脏长大和HCC进展过程中调in vivo biocompatibility节肝细胞增殖的作用。这项工作还提供了一个数据库,这将有助于阐明肝细胞增殖在肝脏长大和HCC进程中是如何调节的机制。