鲷鱼(Pagrosomus major)作为名贵食用鱼类,素有“鱼中之王”的美誉,近年来消费者健康意识及消费水平持续提高,促使我国鲷鱼消费市场快速增长,其产量以近20%的年增速上升,然而其易腐易损问题极大地降低了其食用品质及经济价值。因此,针对性地开发高效的保鲜技术、减少鲷鱼腐败损失尤为重要。优势腐败菌(Specific spoilage organism,SSO)是导致水产品腐败的主因。而SSO自身的群体感应(Quorum sensing,QS)系统能够通过感知其分泌的N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHLs)等信号分子来调控下游关键致腐因子的表达,从而加速水产品腐败。因此通过阻断QS系统来抑制腐败已成为水产品保鲜的新策略。其中群体感应淬灭(Quorum quenching,QQ)酶能够在不进入细菌胞内的前提下高效降解AHLs,因此其不易引发耐药性,被认为是一种极具潜力的新型生物保鲜剂资源。但目前的QQ酶大多存在底物适应性较差的突出问题,且针对水产品SSO筛选的QQ酶鲜见报道。鉴于此,本研究以鲷鱼为对象,针对性地挖掘了对其SSO中QS系统具有淬灭作用的QQ酶,进一步对QQ酶进行体外表达,探究了其酶学性质,并针对筛选得到的QQ酶底物适应性差的突出问题,利用计算机辅助技术对QQ酶进行了理性设计改造,探究了突变酶的腐败抑制效果及作用机制;针对酶制剂环境敏感性强的应用问题,制备了负载突变酶的p H响应缓释型多糖基水凝胶应用于鲷鱼的保鲜,为创新水产品保鲜策略,促进QQ酶在鲷鱼保鲜中的应用提供新的思路。1.基于鲷鱼腐败抑制的QQ酶的筛选及其生物信息学分析。探究了鲷鱼4℃贮藏过程中的菌相变化,其中肠杆菌目(Enterobacteriales)及气单胞菌目(Aeromonadales)分别为鲷鱼贮藏过程中的优势菌目,其中Aeromonadales在贮藏第10 d占比超过50%,达到绝对优势地位,而Enterobacteriales在贮藏第6 d后占比逐渐下降。进一步明确了鲷鱼SSO为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)BY-8,其主要分泌C_6-HSL、C_8-HSL、C_(10)-HSL、C_(12)-HSL、C_(14)-HSL的中长链AHLs。此外,从56株来源于水产环境中的耐冷性菌株中筛选得到对A.veronii BY-8中QS系统具有显著淬灭效果的QQ菌株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PF08,并在其染色体基因组中编号为PF8＿GM002571的编码区(Coding sequence,CDS)中发掘得到一种新型QQ酶PF2571。经生信分析表明其为一种潜在的AHLs酰化酶。2.PF2571酶的体外高效表达纯化及酶学性质研究。对PF2571的密码子进行了优化,使其在Escherichia coli系统下的密码子利用频率高于40,CAI值提升至0.8。进一步构建了基于内源信号肽、外源信号肽以及体外成熟策略的p ET28a-PF2571、p ET32a-PF2571以及p ETduet-PF2571三种表达载体,电泳结果表明在理论分子量区域均出现单一明亮条带,其中p ETduet-PF2571载体在三种表达策略中的单位培养液活性最高,达到0.079 U/m L。对PF2571酶的催化模式进行分析,结果表明PF2571酶能够靶向催化C_(10)-HSL酰基侧链处的酰胺键,Pathologic response产生标志性产物正葵酸,证明其为AHLs酰化酶。酶学性质分析结果表明PF2571酶的最适底物为C_(10)-HSL,最适反应温度为30℃,最适p H为8.0,且PF2571酶具有一定的低温耐受性,5℃下的相对活性能够保持在最适温度下的67.56%,4℃贮藏96 h后其相对活性维持在80%以上。但PF2571酶未检测到C_6-HSL降解活性,对C_8-HSL的催化活性仅为最适底物的20.27%,证明其具有底物偏好性。3.基于序列保守性的PF2571酶活性口袋区域的理性设计。为提高PF2571酶的底物适应性,采用Modeller、Alpha Fold 2、I-TASSER和tr Rosetta四种方法构建了PF2571酶的蛋白模型。拉式图及QMEAN打分结果表明Modeller所构建的模型质量最高。对PF2571酶模型底物结合口袋中24个关键氨基酸进行虚拟饱和突变,结果表明His194>Tyr等12个突变与不同AHLs底物结合的突变能降低。对这些突变进行定点诱变及筛选,结果表明PF2571~(L147Q),PF2571~(N228R),PF2571~(H194Y)及PF2571~(L221R)等对不同AHLs的降解活性增加,进一步对有益突变进行组合突变,结果表明双突变PF2571~(Navitoclax分子量H194Y,L221R)(PF2571~(2MT))对C_6-HSL,C_8-HSL,C_(10)-HSL,C_(12)-HSL及C_(14)-HSL的相对淬灭活性分别为77.62%,76.22%,92.94%,93.25%以及98.52%,与野生型PF2571酶相比首次表现出C_6-HSL降解活性,且对C_8-HSL的降解活性提高了5.7倍。构象分析表明Leu221位及His194位的突变在PF2571蛋白底物口袋底部及头部形成了空间位阻,使活性位点Ser172(Oγ)与C_6-HSL的催化靶点羰基碳原子之间的距离从7.48(?)缩短到2.89(?),与C_8-HSL的相关距离从7.04(?)缩短至2.65(?),导致AHLs配体的对接构象更有利于催化反应的进行。4.基于进化偶联位点的PF2571酶远端区域的理性设计。为进一步提高PF2571酶的底物适应性,利用进化偶联位点分析确定其潜在关键远端氨基酸,结果表明在PF2571序列中预测得到34对ECs打分>1的残基对,根据其空间分布分析获得Agr14/Gln40,Asn84/Glu87等6组潜在关键远端残基。对上述远端残基进行虚拟饱和突变,结果表明Arg14>Lys:Gln40>Asn,Gln116>Cys:Pro134>Met等13个突变与不同AHLs底物结合的突变能进一步降低。对这些突变进行定点诱变及筛选,证明PF2571~(N84T,E87F,H194Y,L221R)(PF2571~(4MT))与野生型酶相比催化C_8-HSL的k_(cat)/K_m值提高了50倍以上,催化长链AHLs的k_(cat)/K_m值提高了1.7倍以上。进一步对不同突变酶进行圆二色谱及分子动力学模拟分析,LY2835219临床试验结果表明Asn84,Glu87,His194及Leu221位突变使蛋白的螺旋比例降低,折叠比例增加,并使PF2571酶与短链AHLs结合时的RMSD值及Rg值增加,增强了蛋白复合物的柔性,提高了残基与AHLs之间的氢键占有率,并显著降低了突变酶与不同AHLs之间的结合自由能及活性中心与相关催化位点之间的平均距离,从而提高了PF2571~(4MT)对不同AHLs的催化效率。5.PF2571突变酶对A.veronii BY-8致腐能力的抑制作用及机制。对突变酶PF2571~(4MT)的生物安全性及其对A.veronii BY-8致腐能力的抑制作用进行了验证,结果表明PF2571~(4MT)酶在1000μg/m L的浓度内对Caco-2细胞的凋亡率无显著影响,具有良好的生物相容性。且其在40μg/m L的浓度下对A.veronii BY-8的生物被膜形成,运动性,碱性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶等胞外酶活性以及藻酸盐与胞外多糖等胞外聚合物的分泌具有显著的抑制作用,抑制率在50%以上。同时,鲷鱼保鲜实验结果表明,PF2571~(4MT)酶显著降低了接种有A.veronii BY-8的鱼片4℃贮藏过程中的挥发性盐基氮值,硫代巴比妥酸值等新鲜度指标及腐败相关酶的活性,延缓了其肌原纤维蛋白的结构损伤,改善了鱼片表面色泽及质构特性,有效提高了鲷鱼的贮藏鲜度及品质。进一步对A.veronii BY-8进行转录组学及荧光定量PCR分析,结果表明PF2571~(4MT)酶处理共造成细菌中420个基因转录水平发生上调,510个基因转录水平发生下调,通过对差异基因进行功能及通路注释,表明PF2571~(4MT)酶能够通过降解AHLs以降低Lux R型AHLs受体蛋白及QS调控因子Rpo S的表达,进而抑制QS系统调控的下游胞外酶等致腐因子以及细菌运动性及生物膜调控蛋白,并通过降低ABC转运系统及产胺关键蛋白的表达抑制致腐因子及胺类物质的分泌,以此降低A.veronii BY-8的致腐能力。6.负载PF2571突变酶的罗望子多糖/聚乙烯醇多功能水凝胶的制备及对鲷鱼的保鲜应用。为了进一步提高理性设计获得的PF2571~(4MT)酶的应用潜力,以苹果酸作为交联剂,罗望子多糖(Tamarind polysaccharide,TPS)和聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)作为基材制备了负载有PF2571~(4MT)的p H响应缓释型多糖基水凝胶。对制备的水凝胶进行表征,并测定了其对鲷鱼4℃贮藏过程中的保鲜效果。理化结构分析表明水凝胶网络通过苹果酸的羧基和聚合物的羟基形成的酯键及分子间氢键建立,且具有典型的三维网络结构,而当TPS与PVA的质量比为2:1时所制备的水凝胶(TPQH-3)具有更好的机械及流变学性能。水凝胶的性能表征结果表明TPQH-3具有快速自愈能力、良好的组织贴合性、剥离特性、拉伸性能、缓释性能以及冷冻耐受性,能够满足水产品冷藏环境需求。此外,TPQH-3水凝胶在p H为6.0和8.0时PF2571~(4MT)释放率分别达到91.93%和89.00%,而在中性环境中释放率仅为63.74%,具有一定的p H响应性。同时,TPQH-3水凝胶有效抑制了A.veronii BY-8的生物被膜及胞外蛋白酶活性,从而提高了其所包裹的鲷鱼块的新鲜度,并延缓了鲷鱼肌肉组织的品质劣变,且其保鲜效果优于游离PF2571~(4MT)酶。