研究背景非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一个日益严重的健康问题,其患病率在发达国家和发展中国家不断上升,估计全球患病率为25%。NAFLD与肥胖等代谢综合征特征密切相关,其特征是在没有酒精过量摄入的情况下,肝细胞内的脂肪堆积。NAFLD开始于简单的脂肪变性,其中5%以上的肝细胞中存在甘油三酯(TG)的积聚,当NAFLD继续发展出现脂肪浸润并伴有炎症时,将导致更严重的NAFLD形式,即非酒精性脂肪性肝炎(NASH),可进一步发展为肝纤维化,最终发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。越来越多的证据表明,NAFLD不仅增加会肝脏相关并发症的发生,同时还会影响其他肝外疾病的发生,如心脑血管疾病,2型糖尿病,慢性肾病以及某些肝外恶性肿瘤(如结肠癌),因此NAFLD的防治已成为当今医学界所关注的热点问题。肥胖与代谢综合征及其合并症(如NAFLD)的发展有关,并增加了这些个Post-operative antibiotics体的死亡风险。有研究报道,肥胖已经成为一个独立的危险因素,使NAFLD的发病风险增加了 3.5倍。同时,全球NAFLD患者中肥胖的患病率为51.3%。肥胖可导致能量失衡,胰岛素敏感性下降和脂肪分解,并改变代谢功能,如胰岛素抵抗和血脂异常,这些都可能导致NAFLD的发生。因此肥胖会影响脂肪组织的代谢,而一旦过多的能量不能储存在脂肪组织内时,这一作用就会被其他器官所代替,肝脏就是其中之一。在这种情况下,来自肝脏的新生脂肪生成增加或皮下脂肪组织BYL719采购摄取减少的循环游离脂肪酸(FFA)可导致异位脂肪堆积和多器官胰岛素抵抗,这被认为是NAFLD发展的主要因素。肥胖导致肝细胞接触到的高水平脂类和碳水化合物可导致肝细胞损伤,进而导致氧化应激反应和线粒体功能障碍,进而引起NAFLD。因此NAFLD的实质是过多脂质沉积在肝脏进而导致肝脏一系列的病理生理变化。自噬是一种保守的细胞自我降解系统,自噬的目的不仅是降解不必要的物质,而且可以回收简单的成分,如氨基酸或单糖,然后可以重复利用,形成更复杂的大分子,从而在饥饿时期维持细胞内稳态和生存。雷帕霉素(mTOR)信号的营养感应机制在调节自噬活性以响应营养的变化方面发挥着关键作用。在NAFLD的背景下,自噬与脂质代谢、胰岛素抵抗、肝细胞损伤和炎症有关。自噬相关基因Atg 14的敲低会引起肝脏甘油三酯(TG)的积累。相反,腺病毒过表达Atg7或Atg14成功逆转了遗传性肥胖模型。总的来说,自噬水平在NAFLD中普遍减少。目前,尚无理想的针对NAFLD的防治药物,饮食习惯、生活方式的改善以及体重减轻仍是NAFLD的首选干预措施,但因患者依从性不佳等原因,效果仍有一定的局限性,难以有效的控制NAFLD及其并发症的发展。大量临床研究表明,减重手术是目前针对重度肥胖人群长期减重和缓解糖尿病最有效、最持久的干预措施。近年来,袖状胃切除术(Sleeve Gastrectomy,SG)因其能有效的降低肝脏脂毒性,延缓甚至逆转NAFLD的进展,逐渐成为全球范围内应用最为广泛的减重手术。虽然关于SG缓解NAFLD的临床研究及基础研究正在逐渐深入,但其潜在机制尚未完全阐明。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种主要由肠道L细胞所产生的激素,通过作用于GLP-1受体,具有促进胰岛素分泌、延缓胃排空的作用,同时GLP-1能够增强肝脏β氧化,减少脂肪形成及脂肪酸的摄取,从而达到减脂降糖的功效。前期研究表明,GLP-1水平在肥胖人群及肥胖动物模型中表达水平降低,接受SG手术后GLP-1水平上升。基于此,深入研究自噬在SG术后GLP-1升高缓解NAFLD过程中的作用,对于明确减重手术的潜在机制及NAFLD的诊断、治疗均有十分深远的意义。本研究通过构建NAFLD大鼠模型,分别行SG和假手术后观察术后脂代谢相关生化指标和肝脏脂质沉积情况。利用Western Blotting对SG术前和术后大鼠的自噬相关指标的表达情况进行了检测,阐明了 SG术后大鼠肝脏组织自噬强弱的改变。然后,我们在体外利用高脂培养基诱导HepG2细胞产生脂毒性,并利用GLP-1类似物进行干预,观察其对脂毒性肝损伤的作用及对自噬的影响;同时,我们在体外阻断了自噬通路,观察GLP-1类似物是否通过自噬作用影响肝细胞的脂毒性;最后,我们在体外阻断了 AMPK通路,观察GLP-1类似物对该通路的影响和自噬的变化,旨在探讨GLP-1类似物改善肝脏脂毒性的分子机制。本研究分以下两部分进行:第一部分:袖状胃切除术后大鼠自噬水平及肝脏脂质沉积的变化第二部分:AMPK/mTOR信号通路在GLP-1类似物增强自噬改善HepG2细胞脂毒性中的作用第一部分 袖状胃切除术后大鼠自噬水平及肝脏脂质沉积的变化研究目的高脂喂养构建肥胖大鼠NAFLD模型,对符合标准的肥胖大鼠行SG手术及假手术,探究SG手术对大鼠的体重、脂代谢的改善情况,以及SG术后大鼠肝脏自噬相关蛋白的表达情况。研究方法1.通过建立高脂饮食诱导肥胖大鼠NAFLD模型,模型使用HE染色评估,同时普通饲料喂养建立阴性对照组(NC组)。造模成功的大鼠随机分为3组,每组10只,分别行SG手术(SG组)及SHAM假手术(SHAM组),另外一组不进行手术(Obesity组)。手术定期测量大鼠的体重、摄食量的改变,以评估手术效果。2.术后8周,分别收集NC组、Obesity组、SHAM组以及SG手术组大鼠的肝脏,并留取血液标本。通过对大鼠肝组织进行HE染色和油红O染色以及对血液样本进行生化指标监测,来评估各组大鼠的肝脏功能和脂代谢的改变。同时,应用Elisa检测各组大鼠的GLP-1表达水平。3.应用Western Blotting检测各组大鼠自噬相关蛋白Beclin-1以及LC3BⅡ/LC3B Ⅰ的表达。4.另取一组成模大鼠,随机分为2组,一组行SG手术,另一组行SG手术的同时腹腔注射CQ阻断自噬。术后8周收集大鼠肝脏检测肝脏脂质沉积情况。研究结果1.体重与摄食量:手术后前两周,SHAM组和SG组的体重和摄食量均呈现下降趋势,后逐步缓慢增加,相对于SHAM组,SG组体重增加和食物摄入量增加量明显减少;而NC组和Obesity组体重呈稳定上升趋势,摄食量未见明显变化。2.肝功能和脂代谢:经过HE染色和油红O染色,SG组相较于Obesity组和SHAM组肝脏脂质沉积明显减少。Obesity组Q-VD-Oph价格和SHAM组的AST、ALT、LDL、TG、TC水平均高于NC组,HDL低于NC组;经SG手术后,上述AST、ALT、LDL、TG、TC水平下降,HDL水平上升,与Obesity组及SHAM组相比,均具有统计学差异。同时,SG组GLP-1水平明显高于Obesity组和SHAM组。3.伴随肝脏脂质沉积的减少,肝脏自噬功能增强:Obesity组和SHAM组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ的表达水平降低,接受SG手术后,相对于Obesity组和SHAM组,Beclin-1、LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ的表达水平升高,提示SG术后大鼠肝脏自噬活性增强。对大鼠行SG手术的同时腹腔注射CQ阻断自噬后,肝脏脂质沉积增多,提示自噬在SG手术减少肝脏脂质沉积中发挥重要作用。研究结论1.SG手术具有减轻体重,改善肝功能及脂代谢的作用;2.SG术后GLP-1水平升高;3.SG术后自噬水平增强,肝脏脂质沉积减少。第二部分:AMPK/mTOR信号通路在GLP-1类似物增强自噬改善HepG2细胞脂毒性中的作用研究目的本部分通过高脂培养基培养HepG2细胞建立高脂环境,然后验证GLP-1类似物对细胞脂代谢的作用,观察这种作用是与自噬相关,然后对GLP-1类似物可能参与的信号通路进行探讨。研究方法1.培养HepG2细胞,将细胞分为以下几组:(1)在正常培养基中培养的细胞,作为正常对照;(2)在游离脂肪酸(FFA)(油酸/棕榈酸=2:1)培养基中培养的HepG2细胞;(3)在补充有GLP-1类似物的FFA培养基中培养的HepG2细胞,GLP-1类似物浓度分别为25nM、50nM、100nM和200nM。2.为了研究GLP-1在自噬中的作用,我们使用靶向Beclin-1的shRNA质粒敲低了 Beclin-1的表达。将细胞分为以下组:(1)在正常培养基中培养的HepG2细胞;(2)在FFA培养基中培养的HepG2细胞;(3)空载体质粒转染HepG2细胞,然后在补充100nMGLP-1类似物的FFA培养基中培养;(4)shBeclin-1质粒转染HepG2细胞,然后在补充100nM GLP-1类似物的FFA培养基中培养。3.为了验证GLP-1调节自噬的信号通路,我们使用了 AMPK抑制剂(Compound C)。将细胞分为以下组:(1)在正常培养基中培养的HepG2细胞;(2)在FFA培养基中培养的HepG2细胞;(3)在补充100nM GLP-1类似物的FFA培养基中培养的HepG2细胞;(4)在补充100nM GLP-1类似物的FFA培养基中培养的HepG2细胞,同时使用Compound C。4.Western Blotting对细胞自噬水平、凋亡通路相关蛋白以及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白进行检测;免疫荧光用于检测自噬流强度;油红O染色用于检测肝细胞内脂质沉积;流式细胞术用于细胞凋亡的检测;qRT-PCR用于内质网应激相关分子检测。5.Western Blotting对大鼠SG术后AMPK和mTOR的磷酸化水平进行检测。研究结果1.GLP-1类似物对FFA诱导的人肝HepG2细胞内自噬水平的影响:与单纯FFA处理相比,随着GLP-1类似物浓度的提高,Beclin-1的表达水平升高和LC3BⅠ向LC3B Ⅱ的转化增多,且两者均呈剂量依赖性的升高。2.通过Western Blotting、免疫荧光和油红O染色证实:相对于单纯高脂培养基处理,GLP-1类似物处理HepG2细胞内脂质沉积减少,内质网应激及细胞凋亡均减少,敲低Beclin-1的表达降低自噬水平后,部分逆转了 GLP-1类似物所致的治疗效果,即细胞内脂质沉积增多,内质网应激和细胞凋亡增多。3.应用AMPK抑制剂后,GLP-1类似物处理的HepG2细胞自噬水平降低,细胞内脂质沉积增多。4.各组大鼠肝组织的总mTOR水平无明细差异,接受SG术后,相较于SHAM组和Obesity组,mTOR的磷酸化水平降低,提示mTOR对自噬活性抑制的降低。同样,AMPK的总蛋白水平未见明显差异,而SG组AMPK的磷酸化水平相较于Obesity组和SHAM组明显升高,提示SG术后AMPK的激活。研究结论1.GLP-1类似物对肝细胞自噬信号通路具有促进作用,且这种作用具有一定的剂量依赖性;2.自噬是GLP-1类似物改善肝细胞脂质沉积的机制之一;3.GLP-1类似物通过促进自噬减轻FFA诱导的肝细胞凋亡;4.GLP-1类似物通过促进自噬减轻FFA诱导的内质网应激;5.AMPK/mTOR信号通路参与了 GLP-1类似物在肝细胞引起的自噬;6.SG术后AMPK磷酸化水平升高而mTOR磷酸化水平抑制。