牛乳作为八大类过敏食物之一,其中已发现超过30多种过敏原蛋白具有潜在的致敏性。众所周知,牛乳发酵的酸奶不仅营养价值高风味良好且备受欢迎,同时在发酵过程中还可以改变过敏原结构从而降低其致敏性,是公认的致敏性低且可安全食用的乳制品。有研究表明,大多数Ig E介导的牛乳过敏患者都能耐受酸奶。此外,酸奶更易消化,且消化中的肽段是过敏反应的物质基础。目前,在牛乳过敏中诱导耐受的机制还没有被系统阐明,因此探索酸奶的消化特性和其诱导耐受的工作机制是至关重要的,也可为研发低致敏乳制品提供理论基础和科学依据。本论文以酸奶为研究对象,瞄准主要过敏原蛋白的变化及其消化特性,探索过敏原的降解与特异性抗体结合能力的变化,在此基础上,对其肽段及消化产物中残留肽段的序列、功能和致敏性进行表征,同时采用生物信息学方法确定肽段中主要过敏原的表位信息包括T细胞表位和Ig E表位分析以筛选耐受T细胞表位;并通过致敏小鼠免疫细胞的体外实验进行耐受T细胞表位的鉴定;基于这些数据得到免疫耐受候选肽,同时结合牛乳过敏小鼠的耐受模型,对免疫耐受候选肽进行体内动物模型的验证,通过探讨体液和细胞免疫学变化等进行表征,并对其肠道微生物、代谢和分子机制进行深入探究。研究的主要方法、结果及结论如下:1.选取六种商业化酸奶(Gu Mi酸奶,JSD酸奶,HR酸奶,HN酸奶,JA酸奶,HS酸奶),对其主要过敏原的降解情况和致敏性的变化进行分析。利用SDS-PAGE电泳,RP-HPLC分析不同酸奶中主要过敏原蛋白的变化;Western Blot、ELISA鉴定主要过敏原蛋白Ig G和Ig E的结合能力;液相质谱鉴定酸奶中主要过敏原肽段,并对这些肽段的表位进行分析。结果表明六种酸奶Ig G和Ig E的结合能力均有不同程度的降低,其中Gu Mi酸奶在六种酸奶中Ig G和Ig E的结合能力最低。通过液相质谱检测发现Gu Mi酸奶中的主要过敏原有17个肽段被鉴定,预测发现6个肽段不具有潜在的致敏性。同时,在检测到的肽段中,水解破坏了BLG的6个Ig E表位和酪蛋白的14个Ig E表位。此外,这17个肽段中有13个肽段都位于蛋白质空间结构的内部,推测这JAK抑制剂些肽段被包裹起来,从而被保留。2.牛乳过敏是由消化后的肽段来启动过敏反应的,因此消化后的残留表位才是致敏的关键物质基础。酸奶由于易消化吸收的特点,对其消化肽进行了进一步研究。本部分将酸奶和牛乳分别通过体外模拟婴幼儿胃肠道进行消化,利用Tricine-SDS-PAGE,RP-HPLC,间接ELISA探索在不同消化条件下,乳蛋白的消化稳定性和Ig E结合能力。并采用液相质谱鉴定酸奶消化产物中主要过敏原残留的肽段以及对Caco2细胞的转运吸收能力;并通过生物信息学对肽段进行T细胞表位和Ig E表位等相关信息的分析。结果表明:与牛乳相比,酸奶更容易被消化,Ig E结合能力也显著降低了54.53%,同时成人消化能力明显高于婴幼儿。通过分析婴幼儿和成人消化产物共得到113条主要过敏原肽段,其中38条肽段存在于不同条件所有的消化产物中,说明这些肽段更耐消化。这38条肽段分别有9、3、26条来自于BLG、ALA、酪蛋白。此外,通过生物信息学分析得到11条肽段含有T细胞表位,而不含有Ig E表位且不能诱导IL4的产生,这些肽段可能会诱导牛乳过敏的免疫耐受,为后续的研究提供基础。3.本章通过体外细胞实验进行耐受性表位肽的鉴定。基于胃肠消化产物中检测的主要过敏原肽段,首先选取主要过敏原中含13-20个氨基酸的肽段(排除已报道的含Ig E表位和预测的B细胞表位的肽段)为候选肽段。然后,分离过敏小鼠肠道的肠系膜淋巴结(MLN)和脾脏组织,制成单细胞悬液,用候选肽段分别与脾脏细胞和MLN细胞进行共培养,培养上清进行相关细胞因子的检测,并鉴定细胞中DC表面标志物的变化和CD4~+T细胞亚群中Treg的分化,以得到耐受型T细胞表位。综合所有结果发现,肽段BLG AA71-83、BLG AA136-148和α_(s1)-酪蛋白AA120-132上调了Treg的水平,表明具有诱导免疫耐受的能力,为随后的体内实验进一步验证提供了基础。4.为探索肽段在诱导耐受方面的作用,基于小鼠牛乳过敏模型进行了耐受模型的构建。通过乳清和不同的乳清水解物来诱导耐受,并筛选出较佳的耐受模型。结果显示,干预组的过敏症状评分有显著性降低,且体温也恢复至正常小鼠水平。通过检测小鼠血清中特异性抗体和m MCP-1水平的变化,发现所有干预组的Ig E和m MCP-1水平都有显著性降低,同时仅乳清干预组Ig G、Ig G_1、Ig G_(2a)和Ig A抗体也有显著性降低,且保持在正常小鼠水平。对于细胞因子,干预组中小鼠脾细胞分泌的Th2型细胞因子IL4,IL5,IL13显著下降,且炎症相关细胞因子IL6也显著下降。并通过流式细胞仪检测发现脾细胞中Th2,Th17细胞显著下调,Treg细胞显著上调。且肠系膜淋巴结(MLN)细胞中耐受型CD103~+DC在干预组有显著增加。相关耐受性指标在乳清和不同乳清水解物组间没有显著性差异,说明了乳清和不同乳清水解物在牛乳过敏中都可以诱导耐受的发生。5.基于以上筛选的T细胞表位肽和构建的耐受模型方案,选择了BLG的四条肽段AA 2-14(IVTQTMKGLDIQK)、AA 71-83(IIAEKTKIPAVFK)、AA 84-101(IDALNENKVLVLDTDYKK)和AA 136-148(FDKALKALPMHIR)混合以用来诱导免疫耐受。本部分选用高低剂量的混合耐受表位肽对牛乳过敏小鼠Medicine analysis进行耐受诱导,基于小鼠过敏症状的评分、体温的监测和相关的免疫学指标验证其免疫耐受的能力。相比于过敏组,结果发现体温和症状都恢复至正常小鼠水平,Ig E水平在灌胃低浓度和高浓度肽组有显著降低,m MCP-1在灌胃低浓度和腹腔注射低浓度肽组有显著降低,这些说明了不同条件下肽段的干预会显著影响过敏相关的全身性指标,诱导了耐受的发生。通过检测脾细胞分泌的细胞因子IL4发现在肽段干预组都有显著降低;同时脾细胞中Th2,Th17细胞也在肽段干预组有显著性降低,Treg细胞的分化也有显著增加。此外,MLN细胞中的Th2细胞水平也有显著性降低。这在细胞层面进一步说明了肽段的干预在牛乳过敏小鼠中诱导了耐受的发展。其中相关指标也会受到肽段浓度和干预方式的影响,具体的机制还需要进一步探讨。6.基于以上用耐受表位肽对牛乳过敏小鼠的耐受能力进行评估外,我们还进行了肠道菌群、CD4~+T细胞转录组学和血清代谢组学三方面的探索。结果表明,肽段主要通过调节特定的肠道菌属(Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Enterorhabdus)来诱导牛乳过敏向耐受方向的发展。这些菌属与血清中的关键代谢物也存在显著相关性,如Lachnospiraceae与代谢物L-色氨酸(L-Tryptophan)呈显著负相关;Muribaculaceae与代谢物PI(18:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))呈显著负相关;Enterorhabdus与代谢物L-异亮氨酸(L-Isoleucine),苯丙氨酸(L-Phenylalanine)呈显著正相关。肽段干预受血清中关键代谢物PS-341小鼠DG(18:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)、PW-C003586HMDB0007535、γ-谷氨酸-亮氨酸(Gamma-Glu-leu)、3-甲基吲哚(3-Methylindole)、5-羟基吲哚乙酸甘氨酸(5-Hydroxyindoleacetylglycine)、消旋甲硫氨酸(Racemetirosine)、磺基乙胆碱甘氨酸(Sulfolithocholylglycine)等调控,富集到过敏相关通路有Th1和Th2细胞分化,NF-κB信号通路,Th17细胞分化,B细胞受体信号通路,T细胞受体信号通路。此外,转录基因组测定结果表明关键的差异基因Niban2,Mpzl2,Igkv6-13,Ighv7-3,Ighv4-1,Igkv8-19,Ighv4-2,Ighv7-4,Igkv4-74,Cpd,Mcam,等可以调控抗原处理和呈递,细胞因子受体相互作用,调控免疫系统过程,信号转导,细胞增殖分化等通路;同时功能富集结果表明,肽段干预会显著改变免疫相关功能,包括细胞活化调节,B细胞信号通路,免疫球蛋白的产生,免疫反应调节,免疫应答等。基于以上组学数据分析,揭示了耐受肽段通过关键的肠道菌群、代谢物和基因显著调控过敏相关信号通路和功能,在诱导牛乳过敏耐受的过程中发挥重要作用。