基因治疗是一种将外源基因导入人体的治疗方法,旨在修复或替换人体内的异常基因,达到治疗疾病的目的。尤其在肿瘤治疗方面,基因治疗被认为是彻底、安全治疗恶性肿瘤的希望所在,可通过基因免疫疗法、基因敲除治疗、基因修饰治疗、基因增补治疗等方式实现对恶性肿瘤的治疗。然而无论是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术还是外源基因片段(DNA或RNA)导入的基因治疗策略中,安全高效基因载体的缺乏一直是限制其临床应用的主要瓶颈之一。与病毒型基因载体相比,非病毒基因载体因其更低的免疫原性、较低的生产成本和更大的基因负载能力等优点逐渐受到关注。在非病毒基因载体中,阳离子脂质体、阳离子聚合物Metal bioremediation和纳米粒子等被用于基因递送载体的研究。其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)因其强大的DNA凝聚能力和优良的质子海绵效应成为该领域的研究热点。然而,PEI与DNA、RNA等基因物质构建而成的“载体/基因”递送系统的稳定性较差,体循环过程中易与其他生物大分子结合产生阳离子细胞毒性,且该体系属外来物质极易被人体免疫系统捕获,清除,体循环时间较短,从而导致基因递送效率低下。天然细胞膜因具有高生物安全性和低免疫原性等优点已被广泛应用于药物递送系统的研究。细胞膜表面蛋白的多种生物学作用可赋予纳米颗粒免疫逃逸、长循环时间、靶向传递等功能。因此本课题结合天然细胞膜与PEI两者的功能优势构建并评价了基于细胞膜包衣的肿瘤靶向基因递送系统,具体情况如下。1.基于细胞膜包封PEI/DNA复合物的基因载体构建与评价。首先采用挤压法将红细胞膜(RBCm)和小鼠单核巨噬细胞膜(RAWm)与PEI30k/DNA、PEI70k/DNA复合物按照不同质量比挤压得到一系列质量比梯度的RBCm/PEI30k/DNA、RBCm/PEI70k/DNA(简称RBCm-P30Dc、RBCmP70Dc)RAWm/PEI30k/DNA、RAWm/PEI70k/DNA(简称RAWm-P30Dc、RAWm-P70Dc)复合物,然后对其进行表征。结果显示RBCm-P30Dc、RBCmP70Dc、RAWm-P30Dc、RAWm-P70Dc四种复合物均表现为粒径200～300 nm之间的球状结构,并且与挤压之前的细胞膜相比膜蛋白条带未见明显减少,证明复合物成功合成。两种细胞膜对PEI/DNA复合物的包封效率均高于70%,其中RBCm-P70Dc复合的最大包封效率可达80.31%。在对DNA的结合保护及释放实验中成功证明复合物可以保护DNA免受核酸酶的降解,并在一定条件下可成功释放DNA。在p H=7.4的PBS缓冲液中存放14天粒径电位未发生明显变化,与对应分子量PEI相比,其对蛋白质的吸附性较低,表现出较强的C59配制稳定性。由安全性结果显示,相较于PEI/DNA复合物,使用细胞膜包封后的RBCm-P30Dc、RBCm-P70Dc、RAWm-P30Dc、RAWm-P70Dc复合物在293T及Hela细胞中的存活率均提高了20%左右。由细胞摄入实验可知,使用细胞膜包封之后的复合物在两种细胞中的摄入效率均有提升,其中在293T细胞中提升最为明显,四种复合物的最大摄入效率较未包封之前均提高了10%～15%。由体外转染实验可知,使用细胞膜包封后的复合物在293T与Hela细胞中的转染效率均有明显提高,其中RBCm-P70Dc复合物表现出最高的转染效率,在293T与Hela细胞中的最大转染效率分别为64.36%和15.91%,分别比PEI70k/DNA复合物高11.21%和6.54%。以上结果证明所制备的复合物安全、稳定、高效。2.谷胱甘肽响应的基因载体构建与评价。首先通过巯基丙酸分子中的-COOH与PEI分子中的-NH2缩合使PEI带有巯基,然后在温和条件下与细胞膜表面广泛存在的巯基氧化形成二硫键,将所得产物与DNA共孵育后使用脂质体挤出仪挤压制备得到一系列质量比梯度的RMP30k/DNA与RMP70k/DNA复合物,对其进行表征。结果显示RMP30k/DNA与RMP70k/DNA复合物表现为粒径200～300 nm之间的的球形结构。对DNA的包封效率可达90%以上,可保护DNA不受核酸酶的降解,并且在还原型谷胱甘肽获悉更多(GSH)存在的情况下,对DNA的释放速度及释放效率均有显著提高,表现出强烈的谷胱甘肽响应性。在p H=7.4的PBS缓冲液中存放14天粒径电位未发生明显变化,与对应分子量PEI相比,其对蛋白质的吸附性较低,表现出较强的稳定性。由安全性实验结果可知,RMP30k和RMP70k复合物对293T及Hela细胞的毒性明显低于对应分子量的PEI。由细胞摄入结果可知,293T细胞中RMP30k/DNA与RMP70k/DNA复合物的最大摄入效率分别为64.49%和73.42%,在Hela细胞中分别为51.65%和82.74%,与上一部分样品相比较,复合物在293T细胞中摄入效率没有特别明显的变化,但在Hela细胞中的摄入效率明显提高,其最大摄入效率提高8.32%。由转染实验可知,上一部分样品相比较,引入二硫键的复合物在293T细胞中的转染效率未有明显变化,但在Hela细胞中的最大转染效率提高了4.22%。以上结果证明所制备的复合物具有安全、稳定、高效且靶向释药的特点。3.肿瘤靶向的基因载体构建与评价。利用叶酸(Folic acid,FA)对RMPs/DNA复合物进一步修饰,实现基因的靶向递送。结果显示,FARMP70k/DNA复合物表现为粒径232.63 nm的球形结构,与RBCm相比FARMP70k/DNA复合物大部分膜蛋白得以保留,可以保证FA-RMP70k/DNA复合物中细胞膜的原有性质不会发生较大改变。由安全性实验可知,与RMP70k/DNA复合物相比,FA-RMP70k/DNA复合物对293T和Hela细胞的毒性没有明显变化。由细胞摄入实验可知,与RMP70k/DNA复合物相比,FARMP70k/DNA复合物的摄入效率显著提高,在293T与Hela细胞中的最大摄入效率分别为88.36%和96.08%。由细胞转染实验可知,FA-RMP70k/DNA复合物在293T与Hela细胞中的最大转染效率分别为79.58%和35.09%,与RMP70k/DNA复合物相比较最大转染效率分别提高9.65%和14.96%。以上结果证明引入FA分子可进一步提高复合物的靶向性。综上所述,本课题构建了一种肿瘤靶向谷胱甘肽响应的仿生基因载体,研究表明该体系具有较好的生物相容性、稳定性及靶向性,可显著降低PEI/DNA复合物的细胞毒性提高转染效率。