免疫系统的功能依赖能量供给,能量缺乏会严重影响免疫细胞的生命活动。鱼类时常通过减少甚至停止摄食的行为响应病原侵染,这种能量限制条件下免疫系统的响应机制尚不明确。最近的进展强调了短暂禁食在优化人类和小鼠免疫力方面的关键作用。然而,这种策略是哺乳动物在进化过程中独立获得的,还是代表了脊椎动物共同的逐渐进化的功能,仍然是未知数。T细胞是脊椎动物免疫防御的重要武器,在抗感染、细胞记忆、协助B细胞产生抗体等过程中发挥关键作用。T细胞免疫受到诸多因素的精密调控,其中代谢程序对T细胞的生物学过程、命运决定和免疫功能至关重要。本研究以尼罗罗非鱼为对象,探究了禁食对鱼类T细胞的调控机制,对于了解鱼类T细胞代谢免疫,探讨T细胞免疫的演化具有重要意义。通过分析喂食、禁食3天和7天的罗非鱼脾脏白细胞的转录组,我们发现T细胞可能是免疫系统对禁食反应的主要执行者。进一步的研究表明7天的长期禁食显著诱导了脾脏白细胞或T细胞中促炎性细胞因子IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6和细胞毒性基因Perforin A、Granzyme B的转录表达,及T细胞的凋亡,导致T细胞比例的显著降低和绝对数量的严重缺失,从而损害了罗非鱼的T细胞稳态;而为期3天的短期禁食对罗非鱼脾脏T细胞的炎症反应、凋亡和稳Tofacitinib研究购买态无显著影响。值得注意的是,禁食7天同样导致了脾脏和头肾中Ig M~+B细胞和CD3~-Ig M~-淋巴细胞绝对数量的减少,但减少的幅度均低于T细胞,且头肾CD3~+T细胞的比例受到的影响较脾脏低,说明脾脏T细胞更容易受到营养匮乏的影响。短期禁食导致T细胞体积增加和CD3蛋白表达量的上调,CD3ε、CD8、CD4-1的m RNA水平也被显著诱导,说明短期禁食增强了T细胞的活化程度。此外,使用T细胞丝裂原PHA刺激脾脏白细胞,相较于喂食组,短期禁食的罗非鱼表达更高的IL-2及其受体CD122;白细胞或T细胞中AKT、NF-κB或ERK1/2磷酸化水平均明显增强,证实了短期禁食能够增强罗非鱼T细胞的激活能力。短期禁食罗非鱼的脾脏白细胞或T细胞中自噬相关基因的m RNA表达上调,ULK1磷酸化增强,Beclin-1、LC3B蛋白表达和P62蛋白降解增加;同时在白细胞或CD3~+T细胞中观察到LC3蛋白表达和自噬溶酶体着色更强,表明短期禁食诱导罗非鱼T细胞自噬。阻断短期禁食罗非鱼的自噬,明显增加了T细胞凋亡;损害了PHA刺激引发的NF-κB、AKT、S6的磷酸化,和T细胞激活标志基因CD122、IFN-γm RNA的上调表达,表明短期饮食限制通过启动适度的自噬作用促进罗非鱼的T细胞免疫力。在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染过程中抑制自噬,脾脏淋巴细胞中T细胞比例和绝对数量的显著降低,Brd U掺入减少,表明阻断自噬严重损害了病原体诱导的T细胞增殖。同时,自噬的抑制损害了病原诱导的促炎性细胞因子和细胞毒性基因的转录表达,导致罗非鱼个体死亡率显著增加,说明自噬对于罗非鱼T细胞发挥正常的免疫功能至关重要。此外,我们发现禁食或二甲双胍处理,显著降低了罗非鱼血糖水平,导致LKB1/AMPK通路的磷酸化激活。与抑制自噬结果相似,体外或感染过程中体内阻断AMPK,严重损害了罗非鱼T细胞的激活和病原菌诱导的T细胞增殖,下调了促炎性细胞因子和细胞毒性基因的表达,并加剧了T细胞的凋亡,表明罗非鱼需要AMPK活性维持T细胞的激活、增殖、存活和功能。能量限制下,AMPK信号的阻断抑制了T细胞自噬溶酶体活性的增加,损害了ULK1的磷酸化,并上调了P62蛋白水平,表明AMPK调控罗非鱼T细胞自噬。因此,这些结果表明,AMPK是连接罗非鱼禁食和自噬控制的核心枢纽,短期的能量限制可通过AMPK依赖性自噬促进罗非鱼T细胞免疫。病原菌感染后,白细胞中自噬标志蛋白的表达及溶酶体活性显示自噬水平增加,结合上述结果表明,禁食和病原菌感染都可以触发自噬。相较于喂食组,感染后的72小时内,短期禁食罗非鱼的白细胞或T细胞中自噬标志蛋白的表达和自噬溶酶体活性显示了强大的自噬反应已经启动;感染120小时后恢复正常水平,表明短期禁食能够提早触发AMPK依赖的T细胞自噬,并将自噬控制在可控范围内。这种在感染早期通过短期禁食而触发的自噬调控模式,能够拯救T细胞、降低机体炎症反应和组织损伤,对提高罗非鱼的抗感染免疫具有积极作用。我们的研究还发现短期禁食在促进AMPselleck合成K激活的同时上调了脂联素受体AdipoR1的表达。抗体封闭白细胞的AdipoR1,显著降低了禁食诱导的AMPKα的磷酸化激活,表明Fluimucil Antibiotic IT禁食可通过AdipoR1促进罗非鱼白细胞中AMPK的活化。使用激动剂体外激活白细胞的AdipoR1后,胞内Ca~(2+)浓度明显升高、Ca M和Ca MKKβ的蛋白及AMPKα的磷酸化明显增加,表明AdipoR1能够通过Ca~(2+)-Ca MKKβ信号促进罗非鱼AMPK的活化。进一步的研究发现,罗非鱼白细胞或T细胞中AdipoR1介导的Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号通路参与病原菌感染引发的免疫反应;病原菌感染过程中,使用AdipoR1抗体或Ca MKKβ抑制剂阻断AdipoR1介导的Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号,严重损害了淋巴细胞和T细胞的增殖,降低了促炎性细胞因子和细胞毒性基因的转录表达,并加剧了T细胞的凋亡,表明AdipoR1介导的Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号在罗非鱼T细胞免疫应答中具有不可或缺的作用。因此,以上结果表明,短期禁食可能通过AdipoR1介导的AMPK信号促进T细胞免疫。有趣的是,罗非鱼基因组中缺失脂联素(adiponectin,ADPN),我们尝试探讨了罗非鱼T细胞中AdipoR1的激活机制。罗非鱼CTRP9重组蛋白的存在可以触发Ca~(2+)-Ca MKKβ-AMPK信号的激活,促进T细胞对葡萄糖的摄取及糖酵解关键蛋白的表达,并降低T细胞的凋亡;而抗体封闭AdipoR1,阻滞了补体1q肿瘤坏死因子相关蛋白9(C1q/TNF-related protein 9,CTRP9)对罗非鱼T细胞摄取葡萄糖及糖酵解的促进作用,说明CTRP9能够通过AdipoR1介导的胞内信号调控罗非鱼T细胞的代谢活动。这些研究表明,同为脂肪细胞因子的CTRP9可能作为替代物弥补罗非鱼ADPN的缺失。综上所述,我们阐明了AMPK相关信号通路调控罗非鱼T细胞免疫的机制,研究结果表明,通过限制饮食来优化免疫力是脊椎动物进化中的一种古老策略,为理解T细胞反应的适应性进化提供了新的视角。