至2050年耐药细菌感染将导致全球上千万人死亡,而耐药现象伴随着抗生素在临床的使用广泛发生,是药物治疗面临的严峻挑战。因此,亟需设计和开发新的给药策略以改善细菌乃至耐药菌感染的预防和治疗效果。成孔毒素(Pore-forming toxins,PFTs)属细菌外毒素,是多种细菌感染的主要毒力因子,破坏上皮屏障和免疫系统协助病原菌的侵袭和定殖,是抗细菌感染的主要靶点之一。抗毒力因子策略通过抑制毒素来治疗细菌感染,以非直接的方式杀灭病原菌从而避免产生耐药性。疫苗用于细菌感染防治帮助机体免疫系统识别病原体,产生能有效抵抗细菌感染的免疫反应。抗毒素疫苗将抗毒素策略与疫苗策略进行结合,尽可能地减少细菌耐药现象的产生,传统的抗毒素疫苗(类毒素疫苗)通过变性蛋白的方法来减少毒素抗原的毒性,存在的主要问题是难以同时保证类毒素疫苗的安全性和免疫原性。因此根据成孔毒素的生物特性和作用机制,结合仿生纳米策略构建新的疫苗载体系统具有研究意义。游离成孔毒素可与细胞膜表面的特异性受体结合,折叠组装成多聚体,识别、组装插入细胞膜表面的特定区域,红细胞是众多成孔毒素发挥毒性的主要靶细胞之一,因此可以作为毒素吸附的载体。纳米载体应用于机体后,吸附各种血浆蛋白可以使其维持特定的内源性蛋白功能,产生更多生物学效应。如血液中的免疫球蛋白IgM可以作为天然佐剂,增强纳米疫苗的体内免疫应答。研究表明脂质体吸附IgM后,脾脏B细胞分布显著增加,小鼠经免疫刺激后产生的特异性抗体滴度能长期维持较高水平。本研究构建了一种新型类毒素疫苗,构建仿生纳米载体吸附并中和细菌成孔毒素毒性,进一步通过IgM功能化策略增加抗原递呈、增强免疫应答,为耐药细菌感染防治研究提供新的思路和实验依据。第一部分,叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗的构建与表征。微生物发酵法,大肠杆菌表达系统制备了创伤弧菌溶血素A(Vibrio vulnificus hemolysin A,VvhA)蛋白,SDS-PAGE和Western Blot法对VvhA进行了分析与鉴定,VvhA的蛋白浓度为2 mg/m L,分子量为51 k Da,纯度为90%。以薄膜挥发法制备叶酸修饰的脂质体(FA-Lips),与红细胞膜挤出融合后,制备叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体(RCM-FA-Lips),吸附VvhA制备叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗(RCM-FA-Lips(VvhA))。荧光共定位实验、荧光共振能量转移(FRET)和蛋白质质谱分析验证了红细胞膜和脂质体的膜融合。对RCM-FA-Lips(VvhA)进行表征,RCMFA-Lips(VvhA)呈类球型膜状结构,马尔文粒径仪测得平均粒径为122.9±2.3 nm,Zeta电位为-24.5±1.3 m V。第二部分,叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体毒素中和能力以及安全性考察。抗溶血实验结果表明了RCM-FA-Lips能够以一定质量比完全中和VvhA毒素,体外抗溶血率达到98.78±0.08%,RCM-FA-Lips与VvhA质量比为8:1。CCK-8法考察RCM-FA-Lips的细胞毒性。结果显示,小鼠肝细胞(AML12)、肠上皮细胞(NCM460)、脐静脉内皮细胞(HUVECs)中,RCM-FA-Lips(VvhA)组细胞存活率分别为97.59±0.92%,94.51±4.14%和97.76±1.22%,RCM-Lips(VvhA)组细胞存活率分别为97.78±1.29%,94.90±1.33%和97.62±0.91%,均与对照组具有显著差异(P<0.0001)。通过皮肤解毒实验和VvhA感染小鼠的生存率来评价RCM-FA-Lips的体内解毒能力。小鼠皮肤毒素沾染模型中,RCM-Lips组、RCM-FA-Lips组与阴性对照组(Saline)均无明显皮肤损伤。H&E染色结果表明:RCM-Lips组和RCM-FA-Lips组表皮层结构完整,上皮细胞形态结构正常、排列紧密,真皮层胶原纤维含量丰富,未见明显的炎性改变。在VvhA感染小鼠的生存率实验中,RCM-Lips组和RCM-FA-Lips组小鼠生存率为60%,对VvhA感染的小鼠具有显著治疗效果,而RCMVs和FA-Lips对照组小鼠生存率均为0。采用CD68免疫组化法考察RCM-FA-Lips(VvhA)的组织毒性,BALB/c小鼠尾静脉连续给药7天(78 mg/kg)后24 h观察小鼠心、肝、脾、肺、肾的巨噬细胞阳性数量。结果显示,实验组各组织中无明显阳性细胞出现,与生理盐水组无显著性差异,具有良好的组织安全性。第三部分,叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗的免疫激活作用和免疫保护效果研究。将RCM-FA-Lips(VvhA)与小鼠血清共孵育后,通过SDS-PAGE、ELISA检测法进行分析,RCM-FA-Lips(VvWnt-C59小鼠hA)相对于RCM-Lips(VvhA)组具有更强的吸附血清中IgM的能力。采用激光共聚焦显微镜观察树突细胞对RCM-FA-Lips(VvhA)的摄取,结果表明,BMDCs对RCM-FA-Lips(VvhA)的摄取显著高于RCM-Lips(VvhA)组。研究RCM-FA-Lips(VvhA)在小鼠体内的免疫激活和保护作用。小鼠分为皮下免疫组和静脉免疫组,每七天给药一次,共免疫三次:皮下免疫分为四组,分别皮下注射Saline、甲醛脱毒VvhA、RCM-Lips(VvhA)和RCM-FA-Lips(VvhA);尾静脉组分为两组,分别尾静脉注射RCM-Lips(VvhA)和RCM-FA-Lips(VvhA),其中VvhA剂量均为100μg(2 mg/m L)。ELISA结果表明,RCM-FA-Lips(VvhA)组的小鼠血清中均具有更高滴度的VvhA特异性抗体。RCM-FA-Lips(VvhA)皮下免疫组小鼠的血清抗体滴度是甲醛脱毒VvhA组的16倍(P<0.0001),是RCM-Lips(VvhA)组的2倍(P<0.0001)。RCM-FALips(VvhA)尾静脉免疫组小鼠的血清抗体滴度是RCM-Lips(VvhA)组的1.6倍(P<0.001)。说明无论是皮下还是静脉注射给药方式,RCM-FA-Lips(VvhA)均能刺激机体产生更高的血清抗体滴度。激光共聚焦观察淋巴结生发中心的形成,并通过流式细胞术定量分析,RCM-FALips(VvhA)均显著增加小鼠体内淋巴结生发中心B细胞的百分比。皮下免疫的RCMMirdametinib分子式FA-Lips(VvhA)组GC B细胞的比例为RCM-Lips(VvhA)组的1.2倍(P<0.01),是甲醛脱毒VvhA组的3.06倍(P<0.0001);尾静脉免疫的RCM-FA-Lips(VvhA)组GC B细胞的比例约为RCM-Lips(VvhA)组的1.35倍(P<0.01),是甲醛脱毒VvhA免疫组的2.13倍(P<0.0001)。免疫小鼠腹腔注射致死剂量的VvhA后,观察小鼠72h内死亡情况,皮下免疫RCM-FA-Lips(VvhA)组和尾静脉免疫RCM-FA-Lips(VvhA)组小鼠生存率为100%,皮下RCM-Lips(VvhA)组小鼠生存率为90%,尾静脉RCMLips(VvhA)免疫组小鼠生存率为80%,甲醛脱毒VvhA免疫组小鼠生存率为60%。说明叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体类毒素疫苗具有更好的免疫保护作用。综上所述,本研究制备了叶酸修饰红细胞膜-杂合脂质体,通过成孔毒素载红细胞膜上的聚集打孔机制,高效负载以创伤弧菌溶血素A作为抗原蛋白,中和毒素毒性的同时,最大限度的保留其抗原portuguese biodiversity活性,构建了一种新型的纳米载体类毒素疫苗。同时,叶酸分子作为结合IgM的靶分子修饰于红细胞膜-杂合脂质体表面,在体内吸附IgM,利用其天然佐剂的作用增强类毒素疫苗的体内免疫应答。研究结果表明,所构建的纳米载体类毒素疫苗具有较好的抗原递呈和免疫激活作用,对模型小鼠产生了较好的免疫保护效果。该系统也可以用于多种细菌类毒素疫苗的制备,为耐药细菌感染防治研究提供新的思路和实验依据。