玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食作物、饲料作物和工业原料,其种植范围几乎遍及全球。随着重工业的快速发展和环境污染的加剧,重金属污染已成为全球最严重的生态环境问题之一。铅(Pb)是一种毒性较强的重金属污染物,对植物的生长发育和生理功能等产生负面影响,它通过食物链、空气和水进入人体对健康造成不可逆的损害。因此,挖掘玉米铅耐受性相关基因并深入解析其遗传和分子机制,对培育低积累或高富集Pb的玉米品种、推进玉米安全生产和Pb土壤生物修复具有重要意义。植物碱性亮氨酸拉链(b ZIP)转录因子是真核生物中广泛分布且相对保守的一个基因家族,其调控植物的生长发育和生理过程,在植物抗寒、抗旱、抗盐和抗热等非生物胁迫中也发挥着重要作用。迄今为止,鲜有关于b ZIP基因调控玉米Pb胁迫耐受性的分子机制报道。课题组前期发现,ZmbZIP54和ZmbZIP107转录因子能够增强玉米幼苗对Pb胁迫的耐受性。因此,本研究进一步探索这两个b ZIP转录因子在玉米幼苗响应Pb胁迫过程中的调控网络和耐受性机制。本文结合候选基因关联分析、转基因过表达系和突变系表型鉴定、异源表达等方法证实了ZmbZIP54和ZmbZIP107可以增强幼苗对Pb胁迫的耐受性且降低了根系对Pb的吸收。通过Pb离子绿色荧光探针、透射电镜(TEM)、能谱分析(EDS)及不同化学形态测定等技术对细胞中Pb离子的分布、形态及耐受性生理机制进行了鉴定。利用酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)、双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)、酵母单杂交(Yeast one hybrid,Y1H)、双荧光素酶(Luciferase assay,LUC)和转录组分析等技术构建了b ZIP转录因子调控玉米铅耐受性的分子网络。取得的主要结果如下:(1)对272份玉米自交系中ZmbZIP54启动子LXH254溶解度区和基因本体进行了根耐铅系数(RW-LTC)表型的候选基因关联分析,结合启动子LUC活性验证,揭示了ZmbZIP54基因5′-UTR的变异调控了Pb胁迫下ZmbZIP54表达水平,导致了不同玉米自交系对Pb耐受性的变异。证明了水杨酸(SA)信号通过抑制玉米根系中ZmbZIP54表达促进玉米根系对铅的吸收并抑制铅胁迫下根系的发育。(2)酵母突变株Δycf1异源表达ZmbZIP54增强了酵母细胞对Pb胁迫的耐受性。Δycf1-ZmbZIP54的Pb含量相较于WT-p YES2和Δycf1-p YES2分别显著降低了25.7%和42.3%。玉米原生质体亚细胞定位显示ZmbZIP54基因定位于细胞核。q RT-PCR结果显示,ZmbZIP54在玉米各组织部位均有表达,其在三叶期的根中表达量最高。同时,ZmbZIP54的表达受Pb胁迫的诱导,其在根系中的表达水平随胁迫时间的增加呈现先升高后下降的表达趋势。(3)Pb离子绿色荧光探针检测结果显示,Pb主要积累在玉米根尖的分生区和伸长区,ZmbZIP54玉米过表达(OE)株系根尖的荧光强度与野生型对照相比降低了47.57%-77.97%;zmbzip54突变体根尖中的荧光强度与野生型相比增加了42.61%-41.73%。TEM和EDS结果显示,OE株系中的Pb主要以针状沉积物的形式附着在细胞壁上或以聚合物的形式存在于细胞间隙,只有微量的Pb进入细胞内部;突变体株系中的Pb透过细胞壁进入细胞质,与细胞质中的物质形成聚合物并富集在细胞器和细胞质中,使玉米根细胞产生质壁分离,至组织失水死亡。在zmbzip54突变体、野生型W22、OE和野生型B104株系的根尖沉积物中分别检测到了6、5、5、5个含Pb化合物的峰值。其中,突变体中Pb的峰值明显高于野生型W22;OE株系中Pb的峰值明显较低。Pb不同化学形态测定结果显示,在B104和OE株系中,Pb的主要成分是由盐酸取的草酸铅和醋酸取的难溶性磷酸铅,分别占总量的50%-61.7%和12.9%-25%;而W22和zmbzip54突变体株系中,主要是盐酸取态的Pb和由乙醇取的易转移且毒性较大的无机物形态的Pb,分别占总量的42.7%-47.5%和23%-25.7%。(4)双荧光素酶实验(LUC)、酵母单杂交(Y1H)和玉米原生质体LUC活性分析表明,ZmbZIP54与ZmPRP1的启动子结合并促进其转录。时空特异性表达模式分析显示,ZmPRP1在玉米根中表达量最高,被Pb处理诱导表达,且随着Pb处理时间的增加逐渐上调。在zmbzip54突变体的原生质体中回补ZmPRP1,转化体的单位面积内未受损的原生质体数量显著高于阴性对照,表明回补ZmPRP1可以高玉米突变体zmbzip54对Pb的耐受性。酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(Bi FC)分析表明,ZmbZIP5NSC125066 IC504与ZmFdx5在细胞核内发生蛋白互作,二者的互作抑制了ZmbZIP54对ZmPRP1的转录促进作用。在所有遗传材料中,ZmFdx5在对照条件下玉米根的表达量远远高于铅处理条件,说明ZmFdx5与ZmbZIP54主要发生在正常条件下。(5)对ZmbZIP54的过表达、突变体和野生型材料进行Pb胁迫下转录组分析,结果表明,ZmbZIP54基因调控下游非生物胁迫响应通路和植物激素信号传导通路。结合RNA-Seq数据和基因功能注释筛选到了一个编码重金属转运的蛋白ZmNRAMP6,结合Y1H和LUC实验验证了ZmbZIP54通过与ZmNRAMP6的启动子上的G-box元件结合并抑制其转录表达,从而调控玉米对重金属Pb的吸收及转运。(6)构建了由ZmbZIP54介导的玉米幼苗Pb耐受性的分子调控网络。ZmbZIP54蛋白与ZmPRP1启动子结合并促进其转录,ZmPRP1通过改变氧化还原系统的平衡来介导玉米对Pb的耐受性。作为ZmbZIP54的互作蛋白,ZmFdx5作为一个分子开关,控制ZmbZIP54对ZmPRP1表达的调控的转换。在正常条件下,高表达的ZmFdx5通过与ZmbZIP54相互作用抑制ZmPRP1的表达,有助于玉米的节能机制。在Pb胁迫条件下,ZmFdx5表达量显著降低从而减少其与ZmbZIP54的互作,促使ZmbZIP54与ZmPRP1结合并促进其表达,从而调节玉米对Pb胁迫的耐受性。另一方面,ZmbZIP54通过与ZmNRAMP6启动子结合并抑制其表达有效地减少了根系中Pb离子向地上部分的转运,一定程度上保护了地上部分免受Pb的毒害。(7)烟草叶片亚细胞定位表明,ZmbZIP107定位于细胞核。组织表达模式分析显示,ZmbZIP107在玉米三叶期的根组织中高表达。在水稻中异源表达ZmbZIP107增强了幼苗对Pb的耐受性,在Pb胁迫处理条件下OE系的总根长(TRL)、根表面积(TSA)、根delayed antiviral immune response数比(BSH)、初生根长(PRL)、最大根数(MNR)和株高(SHL)相较于野生型显著高了7.3%-21.9%。对Pb含量测定发现与野生型相比,OE株系的根系中Pb含量显著降低了42.3%和41.4%,但地上部分的Pb含量无显著差异。表明高ZmbZIP107在水稻株系中的表达可以有效抑制根系对Pb的吸收,进而缓解Pb对幼苗的毒害。