甜味蛋白monellin具有甜味强度高、产生热量低、在体内可分解成氨基酸供人体吸收利用等优点,并可以作为一种甜味替代品供一些爱糖人士或一些需要严格控制糖摄入的糖尿病患者使用。但是,该蛋白的耐高温能力较弱,严重限制了其在食品、饮料和医药行业中的应用。此外,尽管甜味蛋白monellin在酵母及大肠杆菌中获得成功的异源表达,但考虑到其本身的耐酸碱性和耐热性较差,产量偏低,不能满足工业化生产。因此,通过蛋白质工程的方法优化其性质,是提高该蛋白应用潜力的重要策略。本研究中,将含有单链monellin(MNEI)基因的重组质粒(p ET15b-MNEI)转化到大肠杆菌BL21中进行异源表达,获得的总蛋白液经过离心、超声破壁以及镍柱亲和层析纯化收集目的蛋白,随后由专业小组成员采用双PCI-32765化学结构盲法测定目的蛋白的甜味阈值,测得野生型monellin阈值为1.12μg/m L。通过圆二色谱仪测定波长190-260 nm处蛋白溶液二级结构的光谱变化情况。然后测定蛋白样品在固定波长222 nm处,从50℃到95℃逐渐升温中的光谱变化情况,代入公式求得蛋白熔点温度(T_m),野生型monellin T_m值为74℃。为了提升monellin蛋白的甜度和耐热性,根据蛋白表面氨基酸的带电性、蛋白内部的疏水性及蛋白内部的范德华力,设计了一系列的突变位点,进而成功构建出数个该蛋白突变体。通过对异源表达的突变体蛋白进行甜味和热稳定性检测,成功筛选出两个优良的突变体蛋白D21N和E2Q/E50N,与野生型monellin相比,突变蛋白的甜味明显增强,甜味阈值分别为0.70μg/m L和0.64μg/m L。其中,突变体E2Q/E50N的热稳定性明显增强,熔点温度上升至78℃。本研究进一步对活性增强的突变体蛋白D21N、E2Q/E50N进行了结构上的模拟,并对蛋白表面电荷的分布进行研究。结果表明,与野生型monellin相比,将蛋白表面带负电荷的氨基酸突变为极性不带电荷的gluteus medius氨基酸,甜味明显得到增强,原因可能是蛋白表面负电荷的减少增强了其与甜味受体T1R2/T1R3的结合。其中,突变体E2Q/E50N稳定性明显提升,分析发现蛋白三维结构发生了一定的局部变化,导致其亲水性增强从而增加了稳定性。本研究采用定点突变的方法增强了甜味蛋selleckchem白monellin的甜度和耐热性,优良性状突变体的构建有利于推动该蛋白的规模化生产,并为monellin蛋白的商业化生产提供了有益的素材。