东北红豆杉是珍贵的濒危药用植物,具有丰富的内生真菌资源。随着致病菌的不断增多,开发新的微生物源的农药已经势在必行。并且随着研究不断的深入,发现植物内生真菌可以抑制病原菌和降低植物病害的严重程度。因此本研究第一篇以东北红豆杉根部为材料,以从根部分离出的真菌为研究对象,采用拮抗活性实验筛选出根部抗菌菌株;并且对根部抗菌菌株分泌的抗真菌代谢产物进行提取、纯化和鉴定,并对抗菌代谢产物作用机理进行研究。其主要研究内容和结论如下:1、以东北红豆杉根部为样本,经过消毒后在PDA培养基上进行分离纯化,共分离出409株根部真菌。通过形态学观察和分子鉴定确定菌株种属,主要为:拟盾壳霉属(Paraconiothyrium sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)、镰孢属(Fusarium sp.)、肉座菌属(Hypocrea sp.)、微壳色单隔孢属(Microdiplodia sp.)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、土赤壳属(Ilyonectria sp.)、篮状菌属(Talaromyces sp.)和间座壳属(Diaporthe sp)。并发现土赤壳属、拟盾壳霉属和曲霉属是东北红豆杉根部真菌的优势种群。2、对分离获得的根部真菌进行拮抗活性检测,发现有3株真菌具有明显拮抗活性,其中根部菌株R3拮抗活性最强。并且对抗菌菌株的抗真菌的活性成分进行提取纯化和核磁鉴定,确定抗菌菌株的抗真菌活性成分为环匹阿尼酸(cyclopyazonic acid,CPA)。以CPA含量和生物量为指标,对抗病菌株菌株的培养条件进行单因素优化,最佳培养基含有马铃薯粉、3%的乳糖和1%的硫酸铵;最佳培养条件为:培养时间6 d,培养温度28℃,p H 6.0。同时,我们也对抗病菌株的培养条件进行响应面优化,最佳培养条件为培养时间6 d,培养温度28℃,p H 6.4。3、对活性成分的抑菌机理进行了研究,发现CPA具有抑制病原菌作用,对葡萄球菌、灰葡萄球菌、尖孢镰刀菌、交流镰刀菌和立枯丝核菌的抑制率均在50%以上,立枯丝核菌的抑菌效果最好。并且通过显微观察,发现CPA抑制立枯丝核菌菌丝生长并影响其分生孢子的产生。我们也测定电解率和丙二醛含量,发现CPA具有较强的抗真菌活性,增加立枯丝核菌菌丝体电解质泄漏和提高立枯丝核菌细胞膜的脂质过氧化。因此,CPA不仅抑制病原菌菌丝生长和分生孢子的产生,而且也通过破坏病原菌的细胞膜来共同抑制病原菌的生长。本研究第一篇对东北红豆杉根部真菌进行分离、纯化和拮抗活性筛选,获得优良根部抗病真菌可为进一步开发利用根部抗病真菌奠定基础,并对根部抗病真菌的抗菌活性成分进行提取、纯化和鉴定,同时研究了抑菌活性成分的作用机理,为后续微生物E-616452体内实验剂量源农药的开发奠定了理论基础。同时,发现东北红豆杉生长缓慢且紫杉醇含量极低,不能满足庞大的医疗市场。随着研究的深入,发现有些真菌能促进和改善植物的生长发育,并能够促进植物中某些代谢产物的积累。本研究第二篇以东北红豆杉根际土壤分离获得的真菌为研究对象,采用选择性培养基筛选根际促生真菌;并且将根际促生真菌应用在东北红豆杉幼苗上,测定了东北红豆杉生长指标;并系统研究对生理指标(抗氧化酶活性)和紫杉烷类代谢产物(紫杉醇、巴卡亭III、三尖杉宁碱、10-去乙酰基紫杉醇)含量影响,以及通过转录组测序来探究其对紫杉醇的生物合成途径影响。其主要研究内容和结论如下:4、以东北红豆杉根际土壤为样本,采用稀释涂布平板法在PDA培养基上进行分离纯化,共分离出649株根际土壤真菌。通过形态学观察和分子鉴定确定菌株种属,主要为:肉座菌属(Hypocrea sp.),土赤壳属(Ilyonectria sp.),曲霉属(Aspergillus sp.),镰孢属(Fusarium sp.),链格孢属(Alternaria sp.),拟茎点霉属(Phomopsis sp.),共头霉属(Syncephalastrum sp.),毛霉属(Actinomucor sp.),丛赤壳属(Nectria sp.),篮状菌属(Talaromyces sp.),间座壳属(Diaporthe sp.),刺盘孢属(Colletotrichum sp.),拟鬼伞属(Coprinopsis sp.)。并发现肉座菌属、曲霉属、拟茎点霉属和共头霉属是东北红豆杉根际土壤真菌的优势种群。5、对分离获得的根际土壤真菌进行体外促生筛选,发现有10株根际土壤真菌具有固氮潜力;有8株根际土壤真菌具有溶磷潜力;有6株根际土壤真菌可以分泌吲哚-3-乙酸;有12株根际土壤真菌分泌蛋白酶。研究发现有6株根际土壤真菌同时具有多种体外促生活性,其中根际土壤真菌GS16分泌吲哚-3-乙酸能力最强,同时具有固氮和溶磷的潜力。以三年生的东北红豆杉幼苗为实验材料,对根际土壤促生真菌进行体内促生活性的研究。研究发现,1×10~5cfu/m L GS16处理的东北红豆杉幼苗比对照组在株高和根长都有显著提高。与对照相比,1×10~5cfu/m L GS16处理的东北红豆杉幼苗侧根数量显著增加。这些结果都说明根际土壤真菌GS16促进幼苗的生长发育。因此,根际土壤真菌GS16不仅具有体外促生活性,同时具有体内促生活性。6、为探究根际土壤促生真菌处理对东北红豆杉生理层面的影响,因而对其处理东北红豆杉幼苗中抗氧化酶(包括POD、SOD和CAT)活性进行检测。研究发现,1×10~5cfu/m L GS16和吲哚-3-乙酸(IAA)处理的东北红豆杉幼苗中抗氧化酶活性随着处理时间增加呈现先上升后下降的趋势;并且1×10~5cfu/m L GS16处理抗氧化酶活性不仅高于其它GS16菌悬液处理抗氧化酶活性,也几乎都高于IAA处理抗氧化酶活性。同时,研究结果表明在1×10~5cfu/m L GS16处理东北红豆杉中抗氧化酶活性最高值主要集中出现在35 d。总体上,根际土壤促生真菌增加东北红豆杉幼苗中抗氧化酶的活性,为东北红豆杉的资源的高效利用提供重要指导意义。7、为探究根际土壤促生真菌对东北红豆杉中目标活性成分积累量的影响,因而对其处理东北红豆杉幼苗中紫杉烷成分含量进行检测。研究发现,1×10~5cfu/m L GS16和IAA处理的biogenic amine东北红豆杉幼苗中紫杉烷类成分积累量呈现先增加后降低趋势;并且1×10~5cfu/m L GS16处理紫杉烷类成分积累量不仅高于其IAA处理紫杉烷类成分积累量,也高于其它GS16菌悬液处理紫杉烷类成分积累量。同时,研究发现在1×10~5cfu/m L GS16处理东北红豆杉中紫杉烷类成分积累量最高值主要集中在35 d时。8、为探究根际土壤促生真菌促进东北红豆杉中紫杉烷类积累对紫杉醇生物合成途径基因的影响,因而进行转录组测序。通过差异基因表达分析,发现1×10~5cfu/m L GS16和IAA处理东北红豆杉中大部分注释差异表达基因分布在代谢过程和细胞过程。同时,研究结果表明IAA处理东北红豆杉差异表达基因GO分类富集途径与1×10~5cfu/m L GS16处理东北红豆杉差异表达基因途径GO分类富集途径很相似,分析主要原因根际土壤促生真菌GS16能够自身分泌IAA与外源施加IAA很可能通过相似途径来调控东北红豆杉中次生代谢产物的积累。通过对根际土壤促生真菌处理的东北红豆杉的紫杉醇的合成途径的分析,研究发现合成途径中有多个关键酶基因显著变化。其中包括参与将紫杉醇的前体化合物3′-N-debenzoyl-2′-deoxytaxol转化为3′-N-benzoyl-2′-deoxytaxol的关键步骤3′-N-去苯甲酰基-2′-去氧紫杉醇N-苯甲酰转移酶显著上调,以及催化紫杉醇前体化合物10-脱乙酰基-10-羟基巴卡桑二烯酮(10-DAB III)转化为紫杉醇的前体化合物7-乙酰氧基-10-羟基巴卡桑二烯酮(10-DAB IIABT-263临床试验)的细胞色素P450酶CYP720B23显著上调和参与紫杉醇合成途径中主要参与关键中间体的转化与合成的细胞色素P450酶CYP750C28显著上调。本研究第二篇对东北红豆杉根际土壤真菌进行分离、纯化和促生活性筛选,获得优良根际土壤促生真菌可为进一步开发利用根际土壤促生真菌奠定基础,并对根际土壤促生真菌进行体内促生实验,同时研究其对东北红豆杉的目标代谢产物含量、生理指标、次生代谢通路的关键基因/酶的影响,为后续东北红豆杉的定向增量培育、紫杉醇的生物合成途径及代谢调控机制的解析和东北红豆杉资源的高效利用提供重要数据参考和理论依据。