果蔬中农药残留超标问题的频发,严重威胁我国食品安全和居民身体健康。随着食品安全监管范围的不断扩大,传统的仪器分析技术难以满足高通量的现场检测需求,亟需研发快速、高效、廉价的检测手段,为基层食品安全监测提供有效工具。因此,本研究以果蔬中高频或超标检出的11种农药(灭多威、霜霉威、甲拌磷、乙霉威、苯醚甲环唑、咪鲜胺、恶霜灵、乙螨唑、哒螨灵、氯吡脲和二甲戊灵)为研究对象,设计并合成半抗原,制备单克隆抗体,开发胶体金免疫层析检测方法,应用于芹菜、黄瓜、柑橘和猕猴桃中上述农药残留的现场快速检测。1、通过引入苯环合成半抗原并制备单克隆抗体针对灭多威、霜霉威和甲拌磷的结构特征,通过引入刚性苯环作为连接臂合成半抗原,有效暴露各靶标农药的特异性化学结构。在此基础上,与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)偶联制备了完全抗原,并经小鼠免疫、血清筛选、细胞融合和杂交瘤筛选,获得了各农药的特异性杂交瘤细胞(灭多威1D10、霜霉威3G9和甲拌磷4C12),进一步获得各农药的单克隆抗体:半数抑制率(IC_(50))分别为49.83、3.24、8.61 ng/m L;抗体亚型分别Ig G2b、Ig G2b、Ig G2a;亲和力常数K_D分别为2.76×10~(10)、3.64×10~(10)、5.43×10~(10) L/mol;上述抗体与其结构类似物的交叉反应率<1%,均为高特异性抗体。2、从中间体出发合成半抗原并制备单克隆抗体根据苯醚甲iCCA intrahepatic cholangiocarcinoma环唑、咪鲜胺、恶霜灵和乙螨唑的合成路线,筛选其合成路线中的关键中间体,引入3～6碳原子长度的碳链作为间隔臂,使其抗原决定簇得以充分暴露,通过引入的羧基或氨基与载体蛋白BSA偶联,制备完全抗原,并以此为基础获得了高特异性单克隆抗体:苯醚甲环唑2F3、咪鲜胺2F2、恶霜灵4B8、乙螨唑2C6,IC_(50)分别为0.64、0.88、3.68、4.04 ng/m L;亲和力常数K_D分别为6.30×10~(10)、4.90×10~(10)、3.56×10~(11)、3.00×10~(10) L/mol,均为高亲和力抗体;抗体亚型分别是Ig G2b、Ig G2a、Ig G2a、Ig G2a。、3、用原药和类似物衍生合成半抗原并制备单克隆抗体针对哒螨灵、氯吡脲、乙霉威和二甲戊灵的结构特征,从原药或其类似物的母核结构衍生半抗原,最大程度保留原有结构完整性的同时,引入了羧基作为Gefitinib价格活性基团。在此基础上制备了单克隆抗体:乙霉威2H7、哒螨灵3C2、氯吡脲4H5和二甲戊灵1E3,IC_(50)分别为:2.93、2.36、0.13和0.46 ng/m L;亚型分别为Ig G1、Ig G2b、I此网站g G1和Ig G2a;亲和力常数K_D分别为2.96×10~(10)、1.40×10~(11)、3.83×10~(10)和1.85×10~(10) L/mol,均为高亲和力抗体;交叉反应实验表明,上述抗体与其结构类似物的交叉反应<1%,均为高特异性抗体。4、建立胶体金免疫分析方法以上述单克隆抗体为核心原料,优化抗体抗原工作浓度以及样品稀释液,制备了胶体金免疫层析试纸条。蔬菜样本用甲醇/水(v/v=1/4)溶液提取后用样本稀释液(0.01 M PBS,p H 7.4,含1%ON-870)稀释两倍后检测,水果样本用甲醇/水(v/v=1/4)溶液提取后,调节p H至中性再稀释三倍后检测,10 min内肉眼判读检测结果,结果显示试纸条在芹菜中苯醚甲环唑、咪鲜胺、甲拌磷、二甲戊灵、哒螨灵和灭多威的肉眼可视检测限(v LOD)低于100 ng/g;黄瓜中的霜霉威、苯醚甲环唑、咪鲜胺、乙霉威、哒螨灵和恶霜灵的v LOD低于25 ng/g;柑橘和猕猴桃中的苯醚甲环唑、乙螨唑、咪鲜胺、哒螨灵和氯吡脲的v LOD低于20 ng/g。更为重要的是通过在层析试纸条上设置5条检测线,优化胶体金标记抗体浓度以及包被抗原浓度,实现了黄瓜样本中咪鲜胺、乙霉威、苯醚甲环唑、霜霉威和恶霜灵的同时检测,v LOD值分别为:2、20、5、20、和2 ng/g;借助胶体金读数仪实现定量检测,对上述5种农药的检测限(LOD)分别为0.24、2.56、0.52、1.31和0.36 ng/g,均低于国家最大残留限量。综上,本论文建立了11种高特异性抗体,研制了满足果蔬中11种农药的免疫层析试纸条,其检测结果和仪器分析方法的结果一致,适合应用于现场快速检测,满足国家最大残留限量的检测要求,为我国食品安全领域的基层高通量快速检测提供了可靠、有效的检测工具。