沙门菌是一种重要的人兽共患病原体,对人类健康和畜牧养殖业构成严重威胁。头孢菌素类药物用于治疗沙门菌感染且效果良好,但该药物在临床的频繁使用极易导致抗生素呈现亚抑菌浓度状态,进而调控生物被膜的形成。目前,亚抑菌浓度抗生素影响沙门菌生物被膜形成的调控机制知之甚少,实验室前期研究发现,亚抑菌浓度头孢噻肟可增强ST34鼠伤寒沙门菌单相变异株SH16SP46生物被膜形成,且1/8MIC(0.03125μg/m L)头孢噻肟增强生物被膜形成能力最强。基于突变体库在正向遗传学研究中的应用潜力,本研究利用转座诱变技术,挖掘头孢噻肟增强生物被膜形成调控网络的重要相关基因,并探究其功能。主要研究结果如下:1.突变体的筛选及转座子插入位点鉴定本研究利用转座诱变技术构建了包含13824个突变体的SH16SP46转座子插入突变体库。在添加和不添加1/8MIC头孢噻肟的M9培养基中鉴定4320株突变体的生物被膜形成能力,共筛选到32株亚抑菌浓度头孢噻肟诱导下生物被膜形成较WT显著下降的突变体。生长能力测定发现,slt、bcsB、bcsC、wecE、lpxP、yedQ、Ipatasertib供应商rpoS、hdfR、nlpD、rbsR、csgD、qseC和silS的单独失活不影响细菌在M9培养基中的生长。无头孢噻肟时,只有slt、bcsB、bcsC和wecE的失活未显著影响细菌生物被膜形成,因此slt、bcsB、bcsC和wecE在头孢噻肟增强生物被膜形成中发挥重要作用。2.slIron bioavailabilityt缺失对亚抑菌浓度头孢噻肟增强沙门菌生物被膜形成的影响为进一步探究slt在1/8MIC头孢噻肟诱导生物被膜形成中的作用,本研究构建了slt和amp G缺失株。无头孢噻肟时,Δslt和Δamp G的生物被膜形成与野生株(WT)相比无显著差异(P>0.05),胞外基质水平和生长曲线也无明显差异;添加头孢噻肟时,Δslt和Δamp G的生物被膜形成和胞外基质此网站水平极其显著下降(P<0.0001),Δslt的生长被明显抑制。革兰染色和扫描电镜观察发现,头孢噻肟处理下,Δslt菌体中央形成凸起,多数裂解;Δamp G胞膜多处也形成凸起。提示Slt有利于降低头孢噻肟对胞壁的损伤,维持菌体活力,这在亚抑菌浓度头孢噻肟增强生物被膜形成中发挥重要作用。3.bcsB、bcsC失活对亚抑菌浓度头孢噻肟增强沙门菌生物被膜形成的影响不管是否添加头孢噻肟,bcsB::Tn和bcsC::Tn的生物被膜形成和胞外基质分泌都较WT显著减少(P<0.01),但OD_(630)仍大于4ODc。此外,头孢噻肟仍可上调bcsB::Tn和bcsC::Tn生物被膜形成和胞外基质分泌。提示尽管纤维素是沙门菌生物被膜的主要胞外基质,但其分泌障碍不会严重破坏生物被膜形成,也不会阻断头孢噻肟诱导生物被膜形成增强。4.wecE失活对亚抑菌浓度头孢噻肟增强沙门菌生物被膜形成的影响无头孢噻肟时,wecE插入失活不影响菌体生长和生物被膜形成(P>0.05);添加头孢噻肟时,wecE::Tn的生物被膜形成、胞外基质产量极其显著下降(P<0.0001)。革兰染色发现,wecE::Tn形态缺陷。提示头孢噻肟作用下,Wec E参与的表面多糖合成在促进菌体黏附聚集中发挥重要作用。5.部分已筛选突变体表型鉴定lpxP、yedQ、rpoS、hdfR、nlpD、rbsR、csgD、qseC、silS的失活不仅显著减少细菌的生物被膜形成和胞外基质合成分泌,阻断头孢噻肟对生物被膜的诱导增强作用,且curli菌毛合成相关基因csgD、csg B的转录水平在9个突变体中均显著下调,提示lpxP、yedQ、rpoS、hdfR、nlpD、rbsR、csgD、qseC、silS突变通过下调curli菌毛合成相关基因转录水平抑制生物被膜形成。本研究成功构建了ST34鼠伤寒沙门菌SH16SP46阵列化突变体库,鉴定了头孢噻肟增强生物被膜形成相关的重要基因,这有助于更深入了解沙门菌生物被膜形成过程,为筛选有效靶标开发新型被膜菌抑制剂提供理论基础和试验依据。