癌症是威胁人类健康的重大疾病之一。传统治疗手段(手术、化疗和放疗)存在难以完全消除癌细胞、容易转移和复发以及对正常组织的副作用等问题。癌症的本质是机体发生基因突变,致使正常细胞转化为癌细胞并进一步演变成恶性肿瘤,肿瘤组织具有免疫抑制性的肿瘤微环境,并在生长代谢、微环境结构和基质组成等诸多方面差异于正常组织。近年来,基于这些差异性发展了多种非侵入、毒副作用小的新型肿瘤治疗策略,如光热治疗(PTT)、基因治疗和免疫治疗等。PTT介导的肿瘤部位局部升温可高效杀伤癌细胞,诱导肿瘤免疫原性死亡(ICD),但也存在光热组织穿透力不理想导致肿瘤残余复发和转移的问题;基因治疗介导的肿瘤异常修复,能从根源上修复肿瘤相关突变基因;免疫治疗则激活患者自身免疫细胞对癌细胞的特异性杀伤,形成免疫记忆保护效应。肿瘤高效治疗应同时考虑对肿瘤细胞杀伤、对免疫细胞的激活和/或对肿瘤细胞(或免疫细胞)突变基因的修复,从而获得增强的治疗效果和长效的肿瘤生长抑制。其关键技术是利用纳米技术和纳米医学最新成果,设计合理的多功能纳米载体体系将不同治疗模式整合于一体。Triterpenoids biosynthesis在众多纳米载体中,树状大分子由于独特的物化性质受到广泛关注。它是一类高度支化、合成性和高度单分散的大分子,具有非常精确的核、内部空间和大量易于功能化的表面基团。其中,基于聚酰胺-胺树状大分子(polyamidoamine,PAMAM)的研究最为广泛,其内部空间和表面官能团可以物理包裹、吸附或化学共轭负载一种或多种造影剂和/或治疗剂,经过功能化(如靶向试剂和抗蛋白吸附试剂)修饰后将其高效递送至肿瘤部位,实施诊断、治疗或诊疗一体化。例如,其聚阳离子性质使其很好地压缩基因,尤其是在内部包裹金纳米颗粒后能维持更好的分子刚性,进一步提升其基因传递效率100多倍,靶向试剂叶酸或多肽RGD修饰后可以靶向相关受体高表达的癌细胞,两性离子修饰后可大大提升血液循环过程中的c-Met抑制剂抗蛋白吸附能力。目前树状大分子纳米载体及纳米药物在肿瘤治疗应用中仍存在部分问题,包括:(1)单一治疗模式往往无法实现抑制肿瘤迁移和侵袭,需联合不同模式治疗手段克服这一局限性;(2)如何利用树状大分子的良好基因压缩性能联合免疫检查点阻断针对性地改造免疫细胞,增强抗肿瘤免疫反应获得长效的免疫记忆保护;(3)PTT治疗过程中,肿瘤细胞会通过协同自噬来清除PTT所产生的受损细胞器或有害物质并逃避免疫监视,导致PTT效果及其引发的免疫响应不佳。针对上述问题,本论文构建了一系列树状大分子纳米药物平台用于肿瘤的光热/免疫治疗联合治疗研究,用于实施强效且长效的肿瘤治疗。本论文的主要内容如下:(1)两性离子修饰的树状大分子包裹硫化铜纳米颗粒用于光声成像介导的肿瘤光热/基因联合治疗PTT因其创伤小,局部杀伤效率高,而受到广泛关注,但单独PTT仍然难以实现完全抑制肿瘤迁移和侵袭,因此需要联合治疗克服这一局限性。近年来无机光热试剂CuS纳米颗粒因良好的近红外吸收和出色的光热转换效率在肿瘤PTT治疗应用方面备受关注。此外,肿瘤高甲基化基因1(HIC1)在肿瘤转移中扮演关键角色,通过基因转染手段使肿瘤高表达HIC1能有效抑制肿瘤转移。本章中我们通过树状大分子纳米平台将对肿瘤细胞的PTT杀伤和基因修复治疗相结合,实施肿瘤生长和转移的抑制。我们构建了具有靶向和抗蛋白吸附性能的树状大分子包裹的硫化铜纳米颗粒纳米平台(RGD-CuS DENPs),以此负载编码HIC1的质粒DNA(p DNA),用于PA成像介导的肿瘤PTT/基因治疗。结果显示,所制备的多功能RGD-CuS DENPs的CuS核平均直径为4.2 nm,其具有良好的胶体稳定性,以及具有优异光热效应(光热转换效率为49.8%)和出色的PA成像能力。此外,两性离子修饰的RGD-CuS DENPs具有良好的细胞相容性,并可实现血清增强型的p DNA-HIC1基因传递。另外,由于表面修饰了RGD靶向肽,RGD-CuS DENPs能够对α_vβ_3整合素高表达的癌细胞实现特异性靶向效果。体内实验结果表明,构建的RGD-CuS DENPs/p DNA复合物在激光照射下可有效杀伤人源三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)抑制其生长。同时,利用p DNA-HC1递送介导的基因治疗可抑制癌细胞的肺转移。(2)两性离子修饰的树状大分子包裹金纳米颗粒用于树突细胞YTHDF1基因沉默增强的肿瘤免疫治疗免疫治疗过程中,由于存在肿瘤细胞免疫逃逸及免疫细胞抗原递呈缺陷,即使肿瘤患者体内存在大量新生抗原,机体抗肿瘤免疫反应仍然较弱,难以实现较好的治疗效果。因此,可利用纳米药物针对性地改造树突细胞中的不利因素,并联合免疫检查点阻断剂,增强抗肿瘤免疫反应。研究发现,树突细胞中的YTHDF1基因高表达会降低其肿瘤抗原交叉呈递能力,导致免疫应答低,难以实现肿瘤的彻底治愈。此外,肿瘤细胞过表达的程序性死亡配体1(PD-L1)免疫检查点抑制分子,会与T细胞表面程序性死亡-1(PD-1)结合,导致T细胞凋亡,从而限制体内免疫反应,发生肿瘤细胞免疫逃逸。本章我们将通过基于树状大分子的纳米平台对免疫细胞进行基因改造,同时结合肿瘤细胞的PD-L1抑制剂,进一步提升抗肿瘤免疫反应。我们构建了抗蛋白吸附试剂两性离子1,3-PS和靶向试剂甘露糖修饰的树状大分子包裹的金纳米颗粒((Au~0)_(25)-G5.NH_2-Man-PS_(20),简称MDNP)负载YTHDF1 si RNA对树突细胞进行基因工程改造,沉默其YTHDF1蛋白表达,促使树突细胞成熟,潜在增强其抗原提呈能力,并联合PD-L1抗体,恢复T细胞杀伤效果,从而实现高效的肿瘤免疫治疗。结果显示,MDNP具有良好的胶体稳定性,其金纳米颗粒(Au NPs)平均尺寸为1.8 nm。另外,由于修饰了Man靶向分子,可以实现对树突细胞的靶向能力。体外研究表明,MDNP和MDNP/si YTH复合物具有良好的细胞相容性,且MDNP/si YTH复合物转染后的DCs能有效下调YTHDF1基因和蛋白水平,增强树突细胞熟化程度,潜在提高其抗原提呈能力。通过构建小鼠皮下肿瘤模型验证了MDNP/si YTH复合物结合免疫检查点阻断剂PD-L1抗体,可有效提高肿瘤治疗效果,增强体内脾脏和肿瘤部分的T细胞免疫响应。(3)树状大分子光热纳米药物用于抑制自噬增强的肿瘤光热/免疫治疗PTT过程中,肿瘤会通过自噬抵抗光热引起的细胞损伤并逃避免疫监视,造成PTT及催生的ICD所带来的免疫响应不佳。此外,免疫抑制性肿瘤微环境和肿瘤中T细胞浸润不足,使得单独的免疫治疗效果并不理想。吲哚菁绿(ICG)是一种小分子光热试剂,可用于荧光示踪和光热治疗;氯喹(CQ)则是一种自噬抑制剂和免疫调节剂,可用于光热治疗中的肿瘤自噬水平抑制和肿瘤微环境改善,提升体内抗肿瘤效率。本章我们通过树状大分子负载光热试剂(ICG)和自噬抑制剂(CQ),在进行PTPF-07321332供应商T同时抑制自噬增强PTT治疗效果同时并实施免疫调节,从而实施高效的肿瘤光热/免疫联合治疗。结果显示,本研究设计的G5.NHAc-ICG/CQ(GIC)纳米药物具有良好的稳定性、生物相容性和光热转换效率(39.7%)。体外研究结果表明,GIC纳米药物在808 nm激光照射下,可以实现CQ介导的自噬抑制,增强PTT杀伤肿瘤细胞的效果,诱导产生细胞凋亡和坏死。此外,PTT效应会进一步诱导肿瘤细胞产生ICD效应,调动免疫刺激损伤相关分子模式,促进树突细胞成熟,激活T细胞免疫反应,实现肿瘤免疫治疗。同时,CQ作为一种免疫调节剂,可以诱导激活NF-κB通路,重新调控肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤的M1型转化,增强免疫反应,提高对肿瘤的杀伤效果。最后,体内动物实验表明,利用GIC纳米药物与PD-L1抗体联合治疗,增强体内免疫反应,诱导产生杀伤性T细胞,可明显抑制荷瘤小鼠原发性肿瘤和远端瘤生长。总而言之,有机结合光热/免疫治疗并针对肿瘤或免疫细胞上的靶标进行改造,有助于实现优良且长效的肿瘤治疗效果。本研究中开发的功能性树状大分子纳米平台为肿瘤联合治疗提供了新的可行性思路,并对基于纳米药物的个性化肿瘤治疗具有重要参考意义。