目的:铜是工业中常用的重金属,我国铜消费一直稳居全球之首,环境铜污染也日趋严重。近来研究表明,肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)病人的癌组织和血清铜水平升高,铜可能与HCC的发展存在紧密的关联,但相关机制尚不明确。自噬有助于肿瘤细胞应对细胞内和肿瘤微环境中的压力,适度的线粒体自噬,可以清除损伤线粒体,维持肿瘤细胞的存活和生长,促进HCC进展。本课题借助血清饥饿肝癌细胞系模型和裸鼠皮下肝癌移植瘤模型,研究铜对线粒体自噬的调控作用,进一步深入探讨铜促进HCC发展的分子机制,为预防肝癌患者病情恶化、减缓肝癌进展、有效减轻肝癌负担提供病因学依据。方法:1.探索适宜浓度Cu~(2+)对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。为了明确Cu~(2+)对肝癌细胞的增殖和凋亡的影响,应用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测不同时点、不同浓度Cu~(2+)暴露后HepG2细胞的细胞活力。q RT-PCR方法检测Cu~(2+)处理96h后细胞周期和增殖相关指标Ki67、增殖细胞核抗原(Prolifselleck合成erating cell nuclear antigen,PCNA)和人髓细胞增生原癌基因(Cellular myelocytomatosis oncogene,C-MYC)的mRNA表达水平,Western Blot方法检测Ki67和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)的活性剪切形式Cleaved-caspase3的蛋白表达水平,并通过Annexin V-FITC/PI双染法检测不同浓度Cu~(2+)处理96h后HepG2细胞凋亡水平。2.应用血清饥饿法探讨适宜浓度Cu~(2+)暴露抑制HepG2细胞凋亡的作用机制。1)采用血清饥饿法,模拟营养缺乏的肿瘤微环境,CCK8测定血清饥饿联合不同浓度Cu~(2+)暴露不同时间后HepG2的细胞活力,后续实验在血清饥饿联合不同浓度Cu~(2+)暴露18h后进行检验。q RT-PCR方法检测Ki67的mRNA水平。使用流式细胞仪测定JC-1荧光探针染色线粒体去极化细胞百分比。Western Blot方法检测线粒体凋亡通路蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2关联X蛋白(Bcl-2-Associated X,BAX)、凋亡酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor-1,Apaf1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase9)的活性剪切形式Cleaved-caspase9和Cleaved-caspase3的蛋白表达水平。Mito SOX线粒体超氧化物指示剂检测线粒体活性氧(mt ROS)含量。丙二醛(MDA)检测试剂测定肝癌细胞内MDA的含量。2)针对线粒体自噬通路,应用Kaplan-Meier Plotter数据库分析FUN14结构域蛋白1(FUNDC1)表达水平和肝癌病人生存期的关系;Western Blot方法检测血清饥饿联合不同浓度Cu~(2+)暴露18h后ULK1、p-S17-FUNDC1、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平和使用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf-A1)后TIMM23、p-S17-FUNAZD6738DC1和LC3-Ⅱ的表达水平;电镜检测自噬溶酶体的数量,并使用荧光染色检测线粒体和溶酶体共定位验证自噬通量。3)使用sh-FUNDC1质粒转染HepG2细胞构建FUNTumor immunologyDC1敲低模型,血清饥饿条件下Western Blot方法检测对照组(sh-NC)、FUNDC1敲低组(sh-FUNDC1)、FUNDC1敲低后并使用100μM的Cu~(2+)处理组(sh-FUNDC1+Cu~(2+))、敲低FUNDC1并使用线粒体特异性抗氧化剂TEMPO预处理组(sh-FUNDC1+TEMPO)的线粒体自噬通路和线粒体凋亡通路相关蛋白的表达水平。TUNEL荧光染色检测上述四组和sh-NC质粒转染后Baf-A1预处理组(sh-NC+Baf-A1)的细胞凋亡水平,Mito SOX荧光染色检测mt ROS水平。3.Hep3B人肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型验证。以人Hep3B肝癌细胞建立裸鼠皮下异种移植瘤模型,待成瘤后根据肿瘤体积和体重分为对照组(Control)和自由饮水接触35μM Cu~(2+)组[Cu~(2+)(35μM)],21天后终止实验,剥离瘤体和脏器称重,最大肿瘤体积不超过2000 mm~3。在此期间每3天记录一次体重和肿瘤体积。免疫组化检测Ki67和Cleaved-caspase3的表达水平。TUNEL荧光染色检测肿瘤组织细胞凋亡水平,ROS荧光染色检测ROS水平。电镜检测肿瘤组织中线粒体自噬小体的存在。Western Blot方法检测线粒体自噬和线粒体凋亡通路蛋白的表达水平。结果:1.适宜浓度Cu~(2+)暴露可抑制HepG2细胞的凋亡。35μM的Cu~(2+)处理96h出现HepG2细胞活力升高的现象,然而增殖相关指标Ki67、PCNA、C-MYC的mRNA表达水平均下调,且Ki67的蛋白表达水平也是下降的,表明细胞活力的升高并非增殖促进引起的。进一步检测凋亡相关指标,流式细胞术检测在35μM的浓度下,HepG2细胞凋亡水平降低,且Cleaved-caspase3的蛋白表达水平下调,表明细胞活力升高的原因可能与抑制凋亡有关。2.适宜浓度Cu~(2+)可上调线粒体自噬通路清除过多的mt ROS,从而抑制HepG2细胞凋亡。1)血清饥饿联合不同浓度Cu~(2+)暴露18h后,在100μM的浓度下出现细胞活力增高的现象。在该时点下,不同处理组的Ki67的mRNA表达没有显著差别。血清饥饿可增加线粒体跨膜电位的丧失,上调促凋亡蛋白Apaf1、Cleaved-caspase9和Cleaved-caspase3的表达水平,并增加HepG2细胞内mt ROS和MDA的含量。100μM的Cu~(2+)可明显减少线粒体跨膜电位的丧失,降低细胞内mt ROS和MDA的含量,并下调BAX、Apaf1、Cleaved-caspase9和Cleaved-caspase3的蛋白表达。2)Kaplan-Meier Plotter数据库分析显示,FUNDC1表达水平较高的肝癌患者的总生存期(Overall survival,OS)和疾病特异性生存期(Disease Specific Srvival,DSS)较短。血清饥饿可以下调ULK1的蛋白表达水平,但ULK1–p-S17-FUNDC1–LC3-Ⅱ线粒体自噬通路还是有一定程度的表达,而Cu~(2+)可以剂量依赖性地上调ULK1的表达水平,并在75和100μM的浓度下明显激活该通路,p-S17-FUNDC1的表达水平升高。使用Baf-A1后,与未使用Baf-A1相比较,TIMM23、p-S17-FUNDC1、LC3-Ⅱ的表达均升高,且血清饥饿联合Cu~(2+)处理组p-S17-FUNDC1和LC3-Ⅱ的表达升高更明显,表明自噬流畅通并且Cu~(2+)可以上调ULK1–p-S17-FUNDC1–LC3-Ⅱ线粒体自噬通路。电镜下观察到血清饥饿联合100μM的Cu~(2+)处理后,自噬溶酶体增多,线粒体和溶酶体荧光染色共定位也明显增加,进一步表明自噬流畅通。3)与sh-NC组相比,sh-FUNDC1组的p-S17-FUNDC1的蛋白表达水平降低,促凋亡蛋白BAX和Cleaved-caspase3的表达水平高。与sh-FUNDC1组相比,sh-FUNDC1+Cu~(2+)组可以显著上调ULK1–p-S17-FUNDC1–LC3-Ⅱ通路的表达,TEMPO预处理组则对该线粒体自噬通路没有明显影响,且Cu~(2+)和TEMPO均可降低促凋亡蛋白BAX和Cleaved-caspase3的表达,表明Cu~(2+)对线粒体自噬的促进作用发挥了和线粒体特异性抗氧化剂TEMPO相同的作用。TUNEL荧光结果显示Baf-A1抑制自噬后可显著增高凋亡水平,敲低FUNDC1后,凋亡水平升高但不及Baf-A1抑制自噬后的凋亡程度,而Cu~(2+)和TEMPO均可显著降低凋亡水平。荧光检测mt ROS水平与细胞凋亡的变化趋势一致。3.35μM的Cu~(2+)可上调线粒体自噬通路,降低肿瘤组织细胞凋亡。与Control组相比,Cu~(2+)(35μM)组肿瘤体积和瘤重均增加,瘤重/体重呈增高趋势,两组体重和脏器指数无显著差别,表明35μM的剂量是裸鼠可耐受的非毒性剂量。两组间Ki67的表达没有明显差别,但Cu~(2+)(35μM)组Cleaved-caspase3的表达水平降低,且TUNEL染色结果与其保持一致。Cu~(2+)(35μM)组ROS含量虽有下降趋势但没有统计学意义。电镜下两组均能观察到线粒体自噬小体,且Cu~(2+)(35μM)组溶酶体出现在邻近自噬小体的位置。Cu~(2+)(35μM)组可以上调ULK1–p-S17-FUNDC1–LC3-Ⅱ通路的表达并降低促凋亡蛋白BAX和Cleaved-caspase3的表达。结论:1.适宜浓度的铜离子可在营养缺乏的条件下抑制肝癌细胞的凋亡,而非促进肝癌细胞的增殖,表现出细胞活力升高的现象。2.血清饥饿可以造成线粒体损伤,增加细胞内mt ROS的含量,诱导肝癌细胞经线粒体凋亡通路发生内源性凋亡。3.适宜浓度的铜离子可以上调ULK1–p-S17-FUNDC1–LC3-Ⅱ通路介导的线粒体自噬,清除受损的线粒体,降低细胞内mt ROS水平,以此抵抗血清饥饿诱导的肝癌细胞的内源性凋亡。