樱花素是柚皮素的7-O-甲基化衍生物,存在于紫苏叶、水稻、樱桃等多种植物中,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种活性。目前,樱花素生物合成方面的研究主要是探究了作用于柚皮素7-OH位点的甲基转移酶的催化活力,以及构建了樱花素的合成路径,但没有对柚皮素合成樱花素的限制因素作进一步的分析。本研究以作用于柚皮素7-OH位点的FOMT出发,利用代谢工程手段实现了樱花素在大肠杆菌中的高效合成,为其他甲基化黄酮类化合物的合成奠定了基础,主要研究策略和结果如下:(1)提高甲基供给水平和菌体耐受能力强化樱花素的合成。首先筛选到了具有较高催化能力的黄酮类化合物7位甲基转移酶(F7-OMT),并优化了底物浓度,其次通过强化甲硫氨酸合成路径中关键酶Met A、Cys E的表达、表达与辅因子ATP、NADPH、5’-磷酸吡哆醛(PLP)合成相关的酶来强化樱花素的合成。另外,鉴于樱花素的积累量随着底物柚皮素浓度的提高而降低,从大肠杆菌内源压力应答基因中筛选到柚皮素耐受基因rpo S,当添加600 mg·L~(-1)柚皮素时OD_(600)从5.8提高至12.5,即表达rpo S缓解了菌体压力,樱花素的积累量提升至496.2 mg·L~(-1)。(2)理性设计Pf OMT3强化樱花素的合成。利用Alpha Fold建模甲基转移酶Pf OMT3的结构,采用Discovery Studio软件实现Pf OMT3与柚皮素的分子对接,对底物口袋周围氨基酸进行突变,结合实验验证筛选出樱花素积累量提高的突变体Pf OMT3~(M118L)。接着分析了突变体和野生型的动力学常数K_m值,Pf OMT3~(M118L)的K_m值低于Pf OMT3的K_m值,说明Pf OMT3~(M118L)对底物的亲和力提高。另外,分子动力学模拟表明Pf OMT3和Pf OMT3~(M118L)与配体的结合自由能分别为-16.08 kcal·mol~(-1)和-21.20 kcal·mol~(-1),即突变体的结合自由能较野生型低,且突变体RMSF值也低于野生型,说明突变体结构更稳定。突变后樱花素的积累量提升至551.5 mg·L~(-1)。(3)发酵优化强化樱花素的合成。摇瓶水平上对底物添加时间、镁离子添加量、培养基甘油浓度、碳酸钙添加量进行探究,最适底物添加时间为诱导剂添加3 h后,镁离子最INCB28060 IC50适浓度为10 m M,培养基中甘油最适浓度为8 g·L~(-1),碳酸钙最适Transplant kidney biopsy浓度为8 g·L~(-1),摇瓶水平上樱花素的积累量为725.6 mg·L~(-1)。在5 L发酵罐水平上,探究了诱导剂添加时间、底物添加方式、接种量对樱selleckchem花素积累的影响,5 L发酵罐最优发酵条件为:诱导剂于对数中期(OD_(600)=12)添加;底物分批添加;4%接种量,樱花素的积累量在70 h时为2742.3 mg·L~(-1),为目前所报道的最高产量。