金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是导致人类产生感染性疾病的主要病原菌之一。SA分布广泛,能产生大量生物被膜和分泌大量毒力因子,耐药性高,致病性强,已引起临床上的高度关注。目前,临床上已广泛使用清热解毒类中药辅助进行抗感染治疗,虽然清热解毒中药在体内通常难以达到直接抑制或杀灭细菌的浓度,直接抗菌作用效果不佳,但因其具有良好的抗细菌生物被膜生成、减少细菌毒力因子释放、不良反应较小且不容易出现耐药性、利于人体免疫功能清除细菌的特点,逐渐成为国内外研究和寻找新抗生素的热点。本课题以绿原酸在体内的主要代谢产物没食子酸(Gallic acid,GA)和二氢咖啡酸(Dihydrocaffeic acid,DCA)为研究对象,筛选近几年来源于临床且具有代表性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)菌株进行实验,考察GA和DCA对MRSA的抑菌、抗生物被膜和毒力因子释放作用,并进行相关机制研究。经转录组测序后筛选出差异表达基因,分析其相关生物学过程和作用通路,并对其可能产生影响的通路进行定量PCR和分子对接验证,为从清热解毒中药中发现新抗生素和中药现代化提供思路。实验分为以下三个部分:第一部分:绿原酸代谢产物GA和DCA对MRSA的抑制作用。从近年临床搜集的菌株中,筛选出对GA和DCA MIC值为1 mg/mL的MRSA2106菌株进行实验。生长曲线实验表明两者在较高的亚抑菌浓度下对菌株生长均具有一定的抑制作用;对菌株抗生物被膜实验显示,DCA在亚抑菌浓度下对菌株生物被膜的形成具有明显的抑制作用,而对已形成的生物被膜,GA和DCA也均具有明显的消除作用,其中DCA的作用强于GA。经扫描电镜观察,GA和DCA能明显影响菌株产生生物被膜的形态,能减少粘附物和菌体聚集,利于抗菌药物对生物被膜的穿透。GA和DCA分别与临床常用的抗菌药物头孢克肟,万古霉素,克拉霉素,庆大霉素,左氧氟沙星联合使用,结果显示主要为相加作用,未产生协同及拮抗效应。实验还考察了GA和DCA对菌株释放毒力因子α-溶血素的影响,显示GA和DCA在亚抑菌浓度下均能对α-溶血素的释放产生明显的抑制作用。第二部分:绿原酸代谢产物GA和DCA对MRSA的转录组学分析。为探讨GA和DCA对MRSA菌株抑菌、抗生物被膜和抗毒力因子作用的机制,实验对此进行了转录组学分析。结果显示,GA和DCA对MRSA菌株的感染通路均有明显的下调作用,其中GA能下调该通路中的spa,clfB,isdA基因,上调Agr系统中的agrB,sspA基因,产生可降解Spa粘附蛋白的胞外分泌蛋白,而DCA能下调与感染有关的vra G,spa,dlt D基因,表明GA和DCA均能对MRSA菌株的感染能力和毒力因子释放产生一定影响。转录组学分析也显示,GA和DCA对MRSA菌株的氨基酸合成、组氨酸代谢等其它多条MRTX849分子量生物合成和代谢通路也具有明显的上调或下调作用,表明GA和DCA也能影响细菌的代谢过程。同时,对于生物被膜重要成分PIA的编码基因icaADBC,GA组icaA和INCB018424icaD呈略微下调,但无显著性差异,可能与两种方法的原理和检测灵敏度有关。综上,转录组结果显示,GA和DCA能影响MRSA菌株中感染通路等多条通路中的相关基因,对MRSA的感染能力,如毒力因子释放和生物被膜的生成与消除,产生一定的抑制作用。第三部分:绿原酸代谢产物GA和DCA对相关基因的PCR及分子对接。在上述实验的基础上,根据文献选择MRSA菌株Agr系统中的主要致病基因agrA基因和与耐药相关的生物被膜编码基因icaADBC基因进行定量PCR分析。结果显示,GA在亚抑菌浓度下能下调agrA和icaA,icaD,icaB基因,DCA能下调agrA,icaA,icaB基因,提示两者在亚抑菌浓度下不仅能减少MRSA致病毒力因子的释放,也能抑制生物被膜的形成。同时,分子对接实验也显示GA和DCA均能结合在DNA与AgrA蛋白相互作用的位点上,能干扰DNA与AgrA的结合,影响AgrA的正常功能,从而减少MRSA菌株的致病能力,其中DCA与AgrA蛋白的亲和力比GA更强。综上所述,本论文在前期绿原酸抗感染作用研究的基础上,以绿原酸体内关键代谢产物GA和DCA为研究对象,进一步研究了GA和DCA(特别是DCA)在亚抑菌浓度下对临床常见MRSA菌株生物被膜产生和毒力因子释放的抑制作用。通过药理实验、转录组、PCtendon biologyR和分子对接,对其感染通路中的相关调控机制进行了一定的分析,揭示了天然植物中广泛存在的DCA的应用潜力,为中药的抗菌作用研究和临床抗感染治疗提供一定参考。