1,2,4-三唑类杀菌剂被广泛用于农作物病害防治,同时其在水生态系统的污染问题与对非靶标生物的潜在RAD001半抑制浓度危害也受到越来越多的关注。已知三唑类杀菌剂主要通过抑制14α-羊毛脂醇脱甲基酶(CYP51)活性来阻止真菌细胞膜麦角甾醇的合成,造成杀菌效果,而CYP51同样在真核生物中发挥作用。研究已发现三唑化合物可引起非靶标生物的生殖内分泌干扰效应,但目前其对水生生物的毒性研究仍然不足,尤其对鱼类性别分化干扰机制的研究缺乏系统性和针对性。而基于化合物结构特征的计算毒理学方法在近几年得到了快速发展,但也仍然存在毒性预测的空白需要填补。针对以上问题,本论文研究首先结合激酶筛选、报告基因、实时荧光定量PCR、分子对接与酶活检测的手段对典型三唑类杀菌剂戊唑醇进行毒性机制探索,再以放射性~3H标记雄烯二酮作为反应底物,利用放射性同位素示踪技术,分析23种常用三唑类杀菌剂对芳香化酶(CYP19)活的抑制性,高效灵敏地分析药物间的活性差异,最后构建相关定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)模型。旨在一定程度上填补三唑类杀菌剂所引起的生殖内分泌干扰相关毒性数据的空白,为环境友好型的药物研发和政府对其相关毒性评估监测提供参考。主要结果如下:1.戊唑醇对斑马鱼性别分化分子机制及三唑类杀菌剂的芳香化酶活抑制作用研究。利用激酶抑制剂体外筛选实验发现戊唑醇并未对包括PIK3C2A、AKT、PKA等常见调控体内稳态的113种激酶表现拮抗作用,表明激酶可能不是戊唑醇直接作用靶点。而在CALUX细胞实验中,戊唑醇可引起雄激素受体拮抗效应,表明戊唑醇可引起体内性激素介导信号通路的紊乱。CYP19作为将雄激素向雌激素转化的限速酶,也是生殖系统中重要的生物标志物。将戊唑醇暴露于斑马鱼胚胎阶段(0～5 dpf)和性别分化前期(19～30 dpf),通过q PCR技术研究戊唑醇对斑马鱼芳香化酶相关基因(cyp19a1a,cyp19a1b,ar,esr2a,gata4,nr5a2等)的影响,结果表明在性别分化前期2 mg/L戊唑醇可造成cyp19a1b(0.64±0.04倍)、esr2a(0.49±0.01倍)、esr2b(0.12±0.02倍)、ar(0.42±0.09倍)、gata4(0.39±0.08倍)、cebpa(0.27±0.09倍)和ahr2(0.68±0.03倍)的基因水平显著性下降,而同时加入50 ng/L的雌二醇后cyp19a1b(2.03±0.46倍)、esr2b(0.22±0.02倍)和cebpa(0.45±0.07倍)表现出显著性的补偿效应,推测戊唑醇参与到芳香化酶的调控路径中。将戊唑醇与芳香化酶蛋白结构进行半柔性CDOCKER分子对接后发现其可与该酶形成范德华力、烷基作用等非共价作用力,并于活性中心Heme结构形成π–π堆积作用,推测戊唑醇可能具有竞争性结合芳香化酶催化位点的潜力。进一步通过蛋白序列匹配和同源建模技术发现,人源(CYP19A1)和斑马鱼源芳香化酶(cyp19a1a和cyp19a1b)的蛋白结构,尤其在活性位点具有结构相似性,可相互替代分析。使用荧光检测试剂盒验证了戊唑醇可造成芳香化酶的活性抑制。进一步利用~3H-H_2O释放法分析发现,23种具有三唑结构特征的三唑类杀菌剂对芳香化酶具有不同程度的抑制性,IC_(50)范围为44 n M(最强,氟硅唑)～330μM(最低,联苯三唑醇),其中200μM苯醚甲环唑、100μM腈菌唑和100μM氟环唑可造成酶活的完全抑制。2.三唑类杀菌剂对芳香化酶活抑制效应QSAR模型的构建。受试的23种三唑类杀菌剂对斑马鱼胚胎的急性毒性最高为苯醚甲环唑(LC_(50)=1.96 mg/L),最低为三唑醇(LC_(50)=59.15 mg/L)。在斑马鱼ZF4细胞毒性实验中,IC_(50)范围从71.05μM苯醚甲环唑至728.4μM环丙唑醇,硅氟唑、多效唑、灭菌唑、三唑酮的IC_(50)高于1 m M。将三唑类杀菌剂的胚胎急性毒性、细胞毒性和酶活抑制性进行皮尔逊相关性和线性回归分析发现,斑马鱼胚胎急性毒性与细胞毒性具有正相关性(R~2=0.51),而酶活抑制性与胚胎毒性和细胞毒性并无显著相关性,难以被直接预测。将斑马鱼胚胎急性毒性数据进行不同QSAR模型构建方法的评价,包括1D、2D和3D QSAR。在1D QSAR中,疏水性参数log P与生物活性构建的抛物线模型和双线性模型的R_(adj)~2分别为0.51和0.48。利用分子力场中的化合物空间信息进行Co MFA和Co MSIA分析后,3D QSAR模型显示交叉验证Q~2均远小于0.50。而2D QSAR中对化合物物理化学参数、电性参数和拓扑学参数进行收集,与胚胎急性毒性进行逐步回归分析,获得模型p LC_(50)=-7.24-0.30×X~VPC_4+0.76×log D-26.15×Q_(N1)-0.08×μ,其R~2和R_(adj)~2为0.91和0.88,表现出良好的拟合性和预测性。将同样的建模方法应用于三唑类杀菌剂对ZF4细胞毒性评价,获得p IC_(50)=-4.20-0.20×N_(Acceptor)+0.51×log P+0.017×PSA,该模型同样具有良好的预测性。https://www.selleck.cn/products/ferrostatin-1.html最Biomass estimation后应用于三唑类杀菌剂对芳香化酶活性抑制评价,获得模型p IC_(50)=-22.94-2.67×E_(HOMO)+0.94×log D-0.72×N_(Donor),模型经内部验证、外部验证、残差评估,均在可接受范围,应用域通过Williams Plot方法定义。3.三唑类杀菌剂对斑马鱼幼鱼性别分化验证。基于QSAR模型的预测性,烯唑醇、粉唑醇和腈菌唑被选择在斑马鱼性腺发育和性别分化阶段(2 hpf～100 dpf)暴露。经解剖分析发现,药物可造成斑马鱼发育的抑制、性腺指数降低和雄鱼比例的增加(VC、烯唑醇、粉唑醇和腈菌唑的雄性比例分别为50.95%±12.39%、74.52%±5.73%、83.33%±3.33%和70.00%±17.32%)。结果验证了三唑类杀菌剂的芳香化酶活抑制QSAR模型对斑马鱼的生殖干扰预测能力。本论文研究通过对戊唑醇的生殖毒性机理分析,推广至三唑类杀菌剂,并发现该类化合物对芳香化酶活性的抑制效应,研究进一步将该类化合物的斑马鱼胚胎急性毒性和细胞毒性进行测定,综合不同的毒性终点进行QSAR预测模型的构建,为三唑类杀菌剂在水生环境的潜在风险研究提供相关机制的数据支持,并为加快药物研发和风险评估提供理论指导。