背景磷酸酶张力蛋白同源物(Phosphatase and Tensin Homolog,PTEN)是具有双特异磷酸酶活性的抑癌因子,PTEN在细胞生长、凋亡、粘附、迁移、浸润等方面具有重要作用。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)获悉更多(本文简称线虫)是在研究基础医学、遗传学、细胞生物学等领域都具有一定优势的模式生物。线虫的DAF-18与人类PTEN功能域及活性位点高度同源,研究发现人类PTEN在功能上可以完全替代DAF-18;蛋白磷酸酶功能缺陷的错义突变PTEN(Y138F)与线虫的DAF-18(D137A)突变相似。线虫生命周期由卵孵化为第一阶段(L1)幼虫时期,L1幼虫在没有食物的情况下孵化,后续发育过程停滞,这种发育性停滞被称为“L1 arrest”。daf-18/PTEN突变后,L1arrest时期线虫生存率急剧缩短,成虫时期寿命变化不如L1 arrest时期显著,daf-18/PTEN突变线虫L1 arrest时期的表型优势方便进行研究和有利于正向遗传学快速准确筛选新基因靶点。daf-18/PTEN可在L1 arrestPD-0332991生产商时期控制线虫存活和胚胎后细胞发育,研究发现多个基因靶点和信号通路参与调控细胞的发育,然而这些已知的靶点不能完全恢复daf-18/PTEN突变线虫的生存时间,这说明daf-18/PTEN调控细胞生长和个体生存的机制可能在一定程度上是相互独立的。探索daf-18/PTEN调控L1 arrest期线虫独立于细胞增殖的生存机制及寻找新的靶点,可能为提高人类PTEN相关癌症患者的生存年限的设想有所启发。目的探究在L1 arrest时期恢复daf-18突变线虫生存时间的机制。方法1.通过构建双突变体、遗传上位学检测等方法,探究目前报道的调控细胞分裂的信号通路能否恢复daf-18突变线虫生存时间。2.分别过表达DAF-18脂质磷酸酶缺陷、DAF-18蛋白磷酸酶缺陷、DAF-18双磷酸酶缺陷质粒探究双磷酸酶功能是否影响daf-18突变线虫的生存。3.EMS诱变和正向遗传学方法筛选突变体,同胞相减法和全基因组测序来鉴定突变体SNP和In Del突变基因的具体信息。4.使用RNAi、显微注射转基因技术、CRISPR/Cas9、构建双突变体等方法鉴定linc-133突变位点功能。单分子荧光原位杂交定位linc-133 RNA的位置。5.转录组测序技术评估linc-133获得功能(gain-of-function,GOF)突变线虫的差异基因表达变化,KEGG富集相关信号通路。6.生存检测、DAF-16细胞核易位检测、q RT-PCR和sod-3::GFP表达检测linc-133GOF是否激活转录因子DAF-16。7.RNA pull down、RIP、Western bolt等实验寻找daf-18突变线虫中与linc-133 GOF相结合的蛋白,并验证其在调控DAF-16中的功能。8.使用q RT-PCR、RNAi基因沉默、生存实验和突变株遗传上位性等实验,探究linc-133 GOF与DAF-18蛋白磷酸酶活性是否通过HSF-1相关热激蛋白调控daf-18突变线虫生存的机制。9.Western bolt泛素control of immune functions化蛋白检测和未折叠蛋白反应报告基因hsp-4p::GFP验证linc-133 GOF调控内质网未折叠蛋白泛素化降解途径在维持daf-18突变线虫和DAF-18蛋白磷酸酶缺陷线虫中的作用。结果1.调控daf-18突变线虫细胞分裂的基因或信号通路与生存无关。2.DAF-18脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶功能是维持L1 arrest时期线虫生存所必需的,而DAF-18蛋白磷酸酶功能可能在维持生存中发挥关键作用。3.EMS诱变筛选突变位点后并通过相关实验证明linc-133的突变为获得功能(gainof-function,GOF)突变,linc-133 GOF恢复daf-18突变线虫在L1 arrest时期的生存时间。sm FISH证实linc-133在AVK细胞中特异性表达(cell specific),linc-133 GOF发挥细胞非自主性(cell non-autonomous)调控作用。4.linc-133 GOF通过激活DAF-16转录因子来调控L1 arrest时期生存,而在daf-18突变线虫中,linc-133 GOF与14-3-3蛋白竞争性结合阻碍DAF-16从细胞核易位到细胞质,从而通过DAF-16调控L1 arrest时期生存。5.linc-133 GOF通过HSF-1和P97介导的内质网未折叠蛋白泛素化降解维持蛋白质稳态,从而延长daf-18突变线虫L1 arrest时期生存。结论:DAF-18双磷酸酶功能均参与调控L1 arrest时期线虫的生存。linc-133获得功能突变通过调控DAF-16功能和激活HSF-1相关分子伴侣参与的内质网未折叠蛋白泛素化降解途径来维持daf-18突变线虫生存。