高性能聚对亚苯基苯并二噁唑(p-phenylenebenzobisoxazole,PBO)纤维具有优异的机械性能(刚度、强度和韧性)、高热稳定性和轻质性,广泛应用于汽车和航空航天复合材料、防弹衣和体育用品等。羟基修饰的PBO(hydroxy-p-phenylenebenzobisoxazole,HPBO)纤维表现出更好的光稳定性和界面剪切强度。HPBO纤维的单体2-羟基对苯二甲酸(2-hydroxyterephthalic acid,2-HTA)通常采用化学方法合成,包括2-溴对苯二甲酸催化水解,即在100℃、碱性环境下,铜粉催化2-溴对苯二甲酸生成2-HTA;Koble-Schmitt反应,温度为230-240℃,在K_2CO_3/CO_2和甲酸钾溶剂存在下,3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid,3-HBA)羧化为2-HTA。化学合成法存在空间选择性差,能耗高等问题。本论文开发了2-HTA的生物合成方法,构建了一条2-HTA的非天然生物合成途径,实现以葡萄糖为原料,利用微生物自身的莽草酸途径合成分支酸,随后分支酸经3-羟基苯甲酸合酶和羟基苯甲酸羧化酶催化最终生成2-HTA。主要工作如下:1.途径中关键催化元件的挖掘。酶促Kolbe-Schmitt反应可将酚类化合物与碳酸氢盐/CO_2反应,生成羟基苯甲酸。课题基于酶促Kolbe-Schmitt反应,筛选羟基苯甲酸羧化酶,以3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid,3-HBA)为底物,在芳香酸羧基的对位进行羧化反应,合成2-HTA。选择不同微生物来源的羟基苯甲酸羧化酶:包括来自米曲霉Aspergillus oryzae的2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-Dihydroxybenzoic acid decarboxylase(2,3-DHBD＿Ao),来自尖镰孢Fusarium oxysporum的2,3-DHBD(2,3-DHBD＿Fo)和来自串珠毛孢子菌Trichosporon moniliiforme的水杨酸脱羧酶(SAD＿Tm)作为候选酶,在重组大肠杆菌中表达。采用全细胞催化方法,以3-HBA为底物,进行催化活性的测试。其中来自米曲霉的2,3-DHBD＿Ao显示出最高活性,2-HTA的产量达到108.97±2.21μg/L/mg_(蛋白)。2.进行酶工程改造,提高酶活。模拟2,3-DHBD＿Ao晶体(7WKM)和小分子2-HTA的结合,采用Discovery Studio预测酶的活性中心和结合口袋,对活性中心F193位和结合口袋T62进行突变研究。发现F193残基的苯环为催化所必须,当193位突变为脂肪族氨基酸193I、193L,酶活完全丧失,193Y虽然含有苯环,但是活性寻找更多仅为野生型的43%。T62位的突变为62G、62A、62V,酶活分别提高了3.3、8.2、3.7倍。说明减小结合口袋的空间位阻是提高酶活的有效策略。分析结合口袋的疏水性,发现疏水性与酶活呈正相关,表明酶催化活性受疏水性和空间位阻双重影响。结合理性设计的F27G突变,采用双位点突变F27G/T62A,使2-HTA的产量增加24.7倍,达到2.69±0.029 mg/L/mg_(蛋白)。3.优化酶促Kolbe-Schmitt反应工艺,从头合成2-HTA。首先,采用碳酸氢盐作为C1源,发现0.5 M KHCO_3对大肠杆菌和酵母菌株的生长均有抑制作用。而KHCO3浓度低于0.5 M时,羧化效率大幅度下降。改用CO_2作为C1源,进行胞内2-HTA的生产。在酿酒酵母BY4741中构建2-HTA从头合成途径,表达外源3-羟基苯甲酸合酶Hyg5,2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶2,3-immune risk scoreDHBD＿Ao此网站。工程菌株在CO_2环境下,在SC营养缺陷型培养基中发酵培养,48 h时发酵液中2-HTA滴度为5.50±0.71μg/L。4.采用提高生物量、增强中间体胞内积累、提高羧化酶活性等策略,提高2-HTA产量。敲除分支酸下游芳香氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)的合成基因aro7和trp3,可以使得分支酸在胞内积累。因此采用酿酒酵母菌株S228C(△ura3、△aro7和△trp3)作为底盘菌株,表达3-羟基苯甲酸合酶和羧化酶突变体2,3-DHBD＿Ao~(T62A)在CO_2环境中培养36小时合成45.40±0.28μg/L 2-HTA。本论文开发了2-HTA非天然生物合成新途径,为2-HTA工业生产奠定基础,证明了羟基苯甲酸羧化酶在固定CO_2生产对苯二甲酸及其衍生物方面的巨大潜力。