流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,每年季节性流感给全球造成严重的经济损失和社会负担。当下,流感和新冠共感染增加了重症比例及死亡风险。因此,流感的防治依然是医药卫生领域关注的重点。尽管有多种小分子药物已被批准用于治疗流感,但流感病毒突变迅速导致上市药物均已产生耐药性,如M2-S31N突变株、NA-H274Y突变株和PA-I38T突变株分别对金刚烷胺(M2离子通道抑制剂)、奥司他韦(神经氨酸酶抑制剂)和巴洛沙韦(PA抑制剂)耐药。因此,发现具有新机制、新骨架的流感病毒抑制剂尤为迫切。表型筛选是一种能够快速发现具有新机制和新骨架的先导化合物的有效方法。本课题组前期构建Fer-1核磁了基于细胞模型的表型筛选方法,通过对组内化合物库进行筛选,发现一类查尔酮衍生物具有抗流感病毒活性。Time-of-Addition实验及免疫荧光实验结果表明,该类化合物抗流感的作用机制与现有上市药物截然不同——通过阻碍流感病毒核蛋白的核输出进而干扰病毒增殖,该发现为获得新骨架及新机制的流感病毒抑制剂提供了重要线索。经细胞水平的抗病毒活性评价发现,含有2,6-二甲氧基苯基的A9活性最好(对H1N1 PR8、H1N1 pdm09、H3N2、Yamagata 和 Victoria 毒株的 EC50 值分别为 3.51 μM、1.34μM、3.69 μM、2.47 μM和3.87μM),其表现出与上市药物奥司他韦(对H1N1 PR8、H1N1 pdm09、H3N2、Yamagata 和 Victoria 毒株的 EC50 值分别为 3.08 μM、>100 μM、1.08 μM、0.98 μM和2.43 μM)相当的广谱抗流感病毒活性。但美中不足的是A9具有明显的Persistent viral infections细胞毒性(CC50=41.46 μM),这限制了该化合物的进一步研发。此外,由于尚未确定该类化合物的靶标及结合模式,制约了基于靶标的先导化合物的合理优化。鉴于此,为了寻找高效、低毒的流感病毒抑制剂,本论文采用生物电子等排策略和骨架跃迁策略对先导A9进一步结构优化。根据表型筛选得到的初步构效关系,本论文保留了 A9的优势片段2,6-二甲氧基苯基,同时对“警惕结构”α,β-不饱和酮Linker进行封闭代谢位点、生物电子等排替换、稳定共轭体系以及成环等修饰,最终得到了五类共25个目标化合物。在随后的细胞水平活性测试中,大多数化合物与A9相比在毒性方面已经有所降低,其中Linker为1,4-二烯-3-酮类的化合物整体表现出较低的细胞毒性(50 μM下细胞存活率均大于95%)。但该类化合物的抗病毒活性没有明显提升,在50μM下对细胞的保护率仅为70%,仍需进一步优化。基于第一轮的结构优化及活性测试结果,2,6-二甲氧基苯基及1,4-二烯-3-酮Linker为优势片段,因此在第二轮的结构优化中保留。此外,采用骨架跃迁策略对贡献不突出的三甲基吡嗪环进行替换,引入长度递增的烷基链以及体积递增的脂肪环和芳杂环,丰富构效关系,以期提高活性并降低毒性,最终得到了四类共23个目标化合物。细胞活性测试表明,多数化合物与第一系列相比均无明显的细胞毒性(50μM下细胞存活率均大于95%),且抗流感活性均有提高。其中苯环对位含吗啉环取代基的IIB-2对多种高致病株均表现出微摩尔水平的活性(对H1N1 PR8Rapamycin MW、H1N1 pdm09、H5N8 和 Yamagata 毒株的 EC50 值分别为 7.31 μM、4.56μM、9.60μM、和4.82 μM),虽然抗病毒活性稍弱于A9,但其毒性明显降低(CC50>100 μM),为后续研发奠定了基础。基于ⅡB-2具有低毒高效的特征,本论文首先通过免疫荧光和免疫印迹实验对流感核蛋白进行定位和定量。结果显示与空白对照组相比,给药组中核蛋白的含量明显降低,且大都聚集在宿主细胞核中。由于核蛋白出核时已经与流感基因组和聚合酶组装成核糖核蛋白复合物(RNP),因此表明ⅡB-2可以抑制流感病毒RNP的核输出;随后本论文建立了基于胞苷脱氨酶的免疫荧光模型,探究ⅡB-2是否抑制宿主相关的核输出途径。结果表明ⅡB-2并不会影响胞苷脱氨酶的出核,排除了 ⅡB-2阻碍流感病毒依赖的宿主核输出途径的可能,将靶标锁定在流感病毒上;最后通过表面等离子共振实验证明ⅡB-2与流感核蛋白的亲和—解离趋势呈浓度依赖性变化,符合稳态亲和力结合原则(Kd=0.2392 μM),表明ⅡB-2与核蛋白之间存在特异性结合,推测其靶标可能是流感核蛋白。综上,本论文以具有新机制和新骨架的抗流感病毒化合物A9为先导。虽然A9表现出与上市药物奥司他韦相当的抗流感活性,但其明显的细胞毒性严重阻碍了后续药物开发。鉴于此本研究采用生物电子等排策略和骨架跃迁策略对A9进行两轮迭代优化,得到活性稍弱于A9但毒性显著降低的目标化合物ⅡB-2。最后构建相关的免疫荧光、免疫印迹及表面等离子共振等实验模型对其进行初步机制探究,最终推测该类化合物可能作用于流感病毒的核蛋白。本论文的工作为发现新骨架新机制的抗流感药物提供了先导化合物。