芥子油苷是主要存在于十字花科植物中的一种重要的植物次生代谢物质,在植物生长发育、防御反应和抗癌中发挥重要功能。二磷酸尿核苷葡萄糖基转移酶(thiohydroximate S-glucosyltransferase,UGT74B1)负责将硫代肟基酸糖基化生成脱硫芥子油苷。2-含氧戊二酸-双加氧酶(2-oxoglutarate-Biosurfactant from corn steep waterdependent dioxygenase,AOP2)负责将硫氧烷基芥子油苷转化为烯基类芥子油苷,例如催化3-丁烯基芥子油苷(gselleckchem MRTX1133luconapin,GNA)转化为萝卜硫苷(glucoraphanin,GRA)。芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)富含芥子油苷,但具有抗癌活性的萝卜硫苷含量很低。本研究聚焦于解析Boa UGT74B1和Boa AOP2的功能,利用基因瞬时过表达技术过表达Boa UGT74B1基因,利用CRISPR/Cas9技术敲除Boa AOP2基因并获得高萝卜硫苷含量的芥蓝材料。主要的研究结果如下:1.克隆了芥蓝‘四季粗条’Boa UGT74B1基因的单拷贝和Boa AOP2基因的三个拷贝。生物信息分析结果表明,Boa UGT74B1属于糖基转移酶超家族成员,与青花菜Bol UGT74B1同源性最高;Boa AOP2属于2-氧化戊二酸双加氧酶超家族成员,与白菜Br AOP2同源性最高。亚细胞定位结果表明,Boa UGT74B1、Boa AOP2.1、Boa AOP2.2和Boa AOP2.3蛋白分别定位于芥蓝原生质体的叶绿体、细胞核、叶绿体和叶绿体中。2.芥蓝‘四季粗条’组织表达结果表明,在芥蓝成熟期的不同器官中,以幼果中的Boa UGT74B1表达量最高;在不同花器官中,以花蕾期的雌蕊中的Boa UGT74B1表达量最高。Boa AOP2基因3个拷贝的组织表达水平存在明显差异,总体上,Boa AOP2.1基因的表达量高于Boa AOP2.3,远高于Boa AOP2.2。在不同时期和器官中,Boa AOP2.1和Boa AOP2.3均在成熟叶中基因表达量最高;在不同花器官中,Boa AOP2.1在盛花期的雌蕊中表达量最高,Boa AOP2.3在花蕾期的萼片中表达量最高。Boa AOP2.2表达量在整个芥蓝植株中极弱,仅在子叶、幼果、花蕾期的萼片和盛花期的雌蕊中能够检测到较弱的表达。3.在芥蓝中建立了农杆菌介导的基因瞬时过表达技术,并利用该技术瞬时过量表达了Boa UGT74B1基因。Boa UGT74B1基因在芥蓝白花品种‘四季粗条’和黄花品种‘福州黄花’中被分别过量表达了1.53～2.93和3.07～5.30倍。两个品种的Boa UGT74B1瞬时过表达植株叶片中总吲哚族芥子油苷含量分别是对应野生型的1.30～7.11倍和2.13～4.44倍;四种吲哚族芥子油苷含量均增加,在‘四季粗条’芥蓝中以4-甲氧基-吲哚-3-甲基芥子油苷的含量增加最多,达到其野生型的12.14倍,在‘福州黄花’芥蓝中以吲哚-3-甲基芥子油苷的含量增加最多,达到其野生型的22.76倍。4.利用CRISPR/Cas9技术对Boa AOP2基因的3个拷贝进行了编辑,共获得了靶点1(Target 1)的13株和靶点3(Target 3)的14株潮霉素抗性植株,测序表明靶点1的突变率为76.92%,靶点3的突变率为57.14%。靶点1的10个突变体中,包括5个aop2.1aop2.2aop2.3三突变体,2个aop2.1aop2.2双突变体,2个aop2.1aop2.3双突变体和1个aop2.1单突变体;靶点3的8个突变体中,包括3个aop2.1aop2.2双突变体和5个aJQ1抑制剂op2.1单突变体。Boa AOP2.1和Boa AOP2.2基因为组合突变,包括大片段缺失、插入和替换,Boa AOP2.3基因仅为单碱基替换。对boaaop2突变体T1代遗传分析表明,CRISPR编辑的突变能够传递给下一代并部分进行了重编辑。在boaaop2突变体T1代中GRA含量是野生型的11.71～41.29倍(0.082～0.289μmol·g~(-1) FW)),且GRA/GNA比值增加,而总脂肪族芥子油苷和GNA含量减少。