【背景和目的】右心失代偿后的右心衰竭是肺动脉高压患者的并发症和主要死因。心肌纤维化是心力衰竭的主要病理机制。心肌成纤维细胞的激活,分化和细胞外基质的分泌是形成心肌纤维化的重要因素。研究表明结缔组织生长因子(CTGF)是器官的重要纤维化调控因子,CTGF作用广泛:在肝脏纤维化中,参与到肝星状细胞的增殖、分化、粘附、迁移、细胞外基质的释放等;在肾脏纤维化中C3-MA核磁TGF受到TGF-β的调控,通过激活Wnt通路增强胶原蛋白的表达;在心肌纤维化中,CTGF作为中间调节因子,可以正反馈诱导TGF-β的表达,激活肌成纤维细胞,加速纤维化反应。但目前对于其稳定性调控未知。我们前期发现在小鼠肺动脉缩窄(Pulmonary Artery Contraction,PAC)模型术后中出现明显的右心纤维化,去泛素化酶USP7在其中表达明显升高。我们在心肌成纤维细胞中的研究发现USP7与CTGF之间存在相互作用,USP7影响CTGF的泛素化水平,调控成纤维细胞的增殖。本研究旨在探讨USP7可能通过稳定CTGF蛋白调控心肌纤维化的作用。【研究方法】1.C57/BL6小鼠构建PAC模型。实验分为两组:WT Sham组和WT PAC组。Masson染色用于检测右心心肌胶原纤维改变情况。Western blot检测右心心肌组织中USP7的蛋白表达量。2.从SD大鼠新生乳鼠中提取原代心肌成纤维细胞(Neonatal Rat Cardiac Fibroblasts,NRCFs),通过TGF-β刺激构建体外心肌纤维化模型。实验分为两组:空白组和TGF-β模型组。Western blot检测USP7和纤维化相关的标志物蛋白(CollagenⅢ、CTGF、α-SMA)的表达。3.利用质谱技术进行USP7与CTGF的相关性研究。4.采用免疫共沉淀技术,研究USP7与CTGF的相互作用,研究USP7对于CTGF的泛素化水平调控。5.向NRCFs中加入环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)抑制蛋白质的合成,同时抑制USP7的作用。实验分为两组:DMSO+CHX组与P5091+CHX组。Western blot检测CTGF的表达,探讨USP7对CTGF的稳定作用。6.在体外心肌纤维化模型中,运用不同处理抑制USP7的作用(P5091抑制USP7的活性,si RNA干扰USP7的表达)。MTS实验检测心肌成纤维细胞活力,Western blot检测CTGF的表达,探讨USP7对心肌成纤维细胞的增殖和CTGF的调控作用。【研究结果】1.USP7在右心纤Belumosudil溶解度维化组织中表达增加:PAC术后的小鼠右心心肌组织发生明显的纤维化。在小鼠PAC模型建立后的第3天和第7天取出心脏组织,去除心房和左室壁后进行匀浆提取蛋白质,用Western blot检测,结果显示PAC模型组中USP7表达升高。2.USP7在体外心肌纤维化模型中表达升高:提取NRCFs,WesterPreformed Metal Crownn blot结果显示在TGF-β刺激的成纤维细胞中,USP7蛋白表达量明显升高。3.USP7与CTGF相互作用:质谱分析结果显示USP7与CTGF之间存在相互作用。4.USP7稳定CTGF的表达:Western blot结果显示,抑制USP7可以加快CTGF的降解。5.USP7调控CTGF的泛素化:免疫共沉淀结果显示,USP7与CTGF可以互相结合,抑制或敲低USP7可增加CTGF的泛素化水平。6.USP7影响成纤维细胞的增殖和CTGF的表达:MTS结果显示抑制或敲低USP7可降低成纤维细胞活力。Western blot结果显示抑制或敲低USP7可降低CTGF的表达。【结论】1.去泛素化酶USP7在PAC后的小鼠右心心肌组织中表达升高。2.去泛素化酶USP7可能通过CTGF的泛素化降解调控右心心肌组织纤维化进程。