猪链球菌(Streptococcus suis)是对全球养猪业造成重大经济损失的重要细菌病原体,也是一种新兴的人畜共患病原体。S.suis感染会引起脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎和肺炎等临床症状。巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分,可以在不同的微环境中表现出相当大的异质性。巨噬细胞分为两种主要表型:促炎M1型和抗炎M2型。作为主要的免疫细胞,猪肺泡巨噬细胞(PAMs)在肺部形成了抵御S.suis感染的第一道防线。不过原代PAMs制备成本高、操作复杂。PAM-Tang是原代PAMs引入SV40大T抗原的永生化细胞,能够用普通培养液在体外进行连续传代,但永生化的PAM-Tang能否取代原代PAMs成为研究S.suis与巨噬细胞相互作用的理想细胞模型尚不清楚。因此,本研究通过分子生物学实验进行了PAM-Tang细胞系对S.suis的抗感染特性研究。为了评估PAM-Tang的吞噬功能,本研究首先通过活细胞成像对PAM-Tang的吞噬能力进行监测,活细胞成像显示S.suis感染PAM-Tang约15 h后能够被PAM-Tang吞噬,并且在吞噬过程中PAM-Tang中溶酶体数量显著增加(P<0.05);进一步利用电子显微镜观察到PAM-Tang有吞噬泡,并且在吞噬泡中观察到S.suis菌体的存在;以上结果表明PAM-Tang可以有效吞噬S.suis。为确定S.suis感染期间对PAM-Tang极化的影Histochemistry响,利用M1和M2型巨噬细胞特异性抗体对感染后PAM-Tang的极化类型进行分析,结果表明S.suis诱导PAM-Tang发生M1型极化。为探究S.suis是否能诱导PAM-Tang分泌炎性细胞因子,通过ELISA方法检测促炎性细胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α的分泌水平;应用RT-q PCR方法检测IL-6和IL-8的m RNA表达水平;结果表明S.suis可以诱导PAM-Tang细胞分泌促炎性细胞因子。为探究S.suis在PAM-Tang中诱导炎症信号通路情况,通过Western blot方法检测了炎症相关信号通路蛋白的表达情况,结果显示NLRP1和Caspase-1在感染后表达量增加,说明NLRP1炎症小体信号通路被激活,这可能导致大量促炎性细胞因子的释放。同时,磷酸化的ERK1/2和p38蛋白表达量增加,表明MAPK炎症信号通路也参与了S.suis感染期间的炎症反应。为了探究不同毒力S.suis与PAM-Tang之间的相互作用,本研究用不同毒力的S.suis接种PAM-Tang,结果表明与SS2强毒菌株700794的黏附水平(3.4×10~4)相比,SS9无毒菌株W7119对PAM-Tang有更高水平的粘附(2.69PLX5622化学结构×10~6)。通过LDH实验对不同毒力S.suis的细胞毒力测定NSC 125973分子式,结果显示细胞毒性与S.suis的孵育时间呈正相关,并且与弱毒株相比(OD_(492)=1.2),强毒菌株诱导了更高水平的细胞毒性(OD_(492)=2.42)。用TUNEL检测方法对S.suis诱导PAM-Tang的凋亡情况进行分析,结果显示与弱毒株相比(112个/mm~2),强毒菌株在PAM-Tang中诱导更高水平的细胞凋亡(207个/mm~2)。为确定S.suis诱导的PAMs凋亡的信号通路,通过Western blot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达水平,结果表明S.suis在PAM-Tang和原代PAMs中都是通过Caspase和p53依赖的信号通路诱导PAMs细胞凋亡的。总之,本研究表明了PAM-Tang对S.suis的吞噬能力和对S.suis的抗感染免疫反应,同时也证实了PAM-Tang细胞系可作为理想的体外细胞模型开展S.suis诱导PAMs细胞凋亡机制的研究。