马尔尼菲篮状菌病是由马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,T.marneffei)感染引起的深部真菌病。T.marneffei主要感染HIV阳性患者和免疫低下人群。然而随着流动人口的增加,马尔尼菲篮状菌病逐渐超出原来的流行区域,成为死亡率高但易误诊的重要致死性深部真菌病。因此需要深入研究T.marneffei感染的致病机理,寻找临床治疗的新策略。课题组前期研究发现艾滋病患者继发感染T.marneffei后,巨噬细胞来源的细胞因子和趋化因子水平升高,推测单核-巨噬细胞系统在抵抗T.marneffei感染时起至关重要的作用。近年来研究发现,病原菌感染与宿主脂质代谢密切相关,甘油酯、鞘脂、胆固醇和脂肪酸代谢在巨噬细胞的激活和调节抗菌中发挥着多种作用。我们在T.marneffei感染的THP-1巨噬细胞中观察到宿主细胞脂质合成增加,脂滴蓄积。但是这种脂质代谢的异常表现在T.marneffei感染中的作用尚不清楚。本课题通过一系列体内外实验探究巨噬细胞脂质代谢在T.marneffei感染中的作用及相关机制,分为以下三个部分:第一部分巨噬细胞内脂滴在抵抗马尔尼菲篮状菌感染中的作用研究【目的】我们前期在T.marneffei感染的THP-1巨噬细胞中观察到脂质代谢异常,脂滴在细胞内蓄积。本部分内容进一步探究T.marneffei诱导巨噬细胞内的脂滴合成增加以及脂滴在T.marneffei感染中的作用。【方法】建立体外T.marneffei感染THP-1巨噬细胞模型和T.marneffei侵袭性感染小鼠模型。通过脂质组学检测未感染和T.marneffei感染3小时巨噬细胞的脂质代谢物变化,使用激光共聚焦显微镜、ELISA、qPCR和Western Blot等方法检测T.marneffei感染细胞内脂质代谢水平。通过在体外细胞系以及体内小鼠模型上抑制脂滴合成,揭示脂滴在T.marneffei感染中的作用。【结果】1.油红O可将T.marneffei感染后巨噬细胞内增多的空泡染为橘红色,提示空泡为脂滴;激光共聚焦显微镜观察明确T.marneffei感染巨噬细胞内脂滴数量增多,并且细胞内甘油三酯和胆固醇水平升高(P<0.05)。2.脂质组学共鉴定到差异脂质代谢物277个,其中上调脂质代谢物216个,下调脂质代谢物61个。上调脂质代谢物主要包括甘油三酯、胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂,而下调脂质代谢物为甘油二酯和游离脂肪酸。KEGG通路分析显示甘油酯代谢、鞘脂代谢和Fc介导的吞噬作用富集显著。3.T.marneffei感染的巨噬细胞内脂medical simulation质合成关键酶(FAS、ACC1、DGAT-1)和脂滴表面蛋白(Plin2、Plin3)的相对表达量增加,调节脂质合成相关的蛋白及转录因子TLR2、NF-κB、SREBP-1、AKT和m TOR活性增强(P<0.05)。4.脂质合成抑制剂Τ863减少巨噬细胞内脂滴的同时可抑制巨噬细胞吞噬T.marneffei,培养上清促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-37水平降低(P<0.05),巨噬细胞对T.marneffei的清除减弱。5.侵袭性T.marneffei感染小鼠肝脾肿大明显,血浆中IL-1β、TNF-α、IFN-λ、IL-2、IL-6、IL-5、IL-10和IL-12p70水平升高(P<0.05)。与模型组相比,Τ863腹腔注射抑制脂质合成可加重小鼠肝脾肿大,增大肝脏、脾脏和肺脏T.marneffei浸润面积,并且降低血浆中IL-1β、TNF-α、IFN-λ、IL-6、IL-5、IL-10和IL-12p70细胞因子水平,缩短感染小鼠中位生存时间(P<0.05)。【结论】T.marneffei可能通过TLR2/NF-κB/SREBP1通路诱导巨噬细胞合成脂滴。Τ863抑制脂滴合成可减弱巨噬细胞吞噬杀伤T.marneffei,加重感染小鼠脏器菌量负荷,降低小鼠生存率。脂滴增强巨噬细胞吞噬和杀菌功能,有助于宿主抵御T.marneffei感染。第二部分1-磷酸鞘氨醇介导的S1PR2/PI3K/Akt通路在马尔尼菲篮状菌感染巨噬细胞中的作用研究【目的】基于第一部分研究中的脂质组学分析发现鞘脂代谢在T.marneffei感染的巨噬细胞中上调,本研究拟进一步探究鞘脂信号通路在T.marneffei感染巨噬细胞中的作用及相关机制。【方法】建立T.marneffei感染巨噬细胞模型和T.marneffei侵袭性感染小鼠模型,通过透射电镜观察T.marneffei感染巨噬细胞形态学变化,ELISA检测相关脂质活性物质,qPCR和Western Blot检测鞘脂信号通路相关基因和蛋白的表达,组织病理和免疫组化观察感染小鼠脏器病理表现。【结果】1.透射电镜和荧光显微镜发现T.marneffei可被巨噬细胞吞噬,感染后3 h胞内脂滴增多,但随着共培养时间延长,T.marneffei在巨噬细胞内增殖。2.与对照组相比,T.marneffei感染巨噬细胞的培养上清中1-磷酸鞘氨醇(S1P)水平升高,巨噬细胞内Sphk2、S1PR1和S1PR2的mRNA表达增加,S1PR1和S1PR2蛋白表达上调,PI3K和Akt磷酸化增强(P<0.05)。3.与对照组相比,T.marneffei侵袭性感染小鼠肺脏S1PR1和S1PR2蛋白表达上调,PI3K和Akt磷酸化增强;免疫组化显示随着感染加重,小鼠肺脏S1PR2表达逐渐增强(P<0.05)。4.S1P腹腔注射加重小鼠肺脏T.marneffei浸润,JTE-013选择性抑制S1PR2减轻小鼠肺脏T.marneffei菌量负荷,延长小鼠生存时间。【结论】T.marneffei感染上调巨噬细胞鞘脂代谢,激活巨噬细胞S1P/S1PR2/PI3K/Akt通路,可能介导T.marneffei在细胞内增殖,抑制S1P信号通路是马尔尼菲篮状菌病潜在的治疗靶点。第三部分马尔尼菲篮状菌感染巨噬细胞的蛋白质组学分析【目的MS-275说明书】我们前两部分研究发现T.marneffei感染的巨噬细胞脂质代谢显著变化,细胞内脂滴合成增加,鞘脂代谢上调,而T.marneffei感染导致宿主巨噬细胞脂质代谢改变的机制不清。故通过高通量组学技术在蛋白质水平初步探索T.marneffei与巨噬细胞的相互作用及巨噬细胞内脂质代谢变化的相关机制。【方法】提取未感染和T.marneffei感染后3小时的巨噬细胞总蛋白,采用高通量4D-Fast DIA蛋白定量组学技术,结合生物信息学系统分析T.marneffei感染后的巨噬细胞中差异表达的蛋白质及与脂质代谢相关的机制,并通过Western Blot对筛选的差异蛋白进行验证。【结果】1.蛋白质组学分析鉴定出5998种蛋白,其中可定量比较蛋白数5986个。以1.5倍差异表达变化为阈值,共鉴定到720个差异表达蛋白,其中368个蛋白表达上调,352个蛋白表达下调。干扰素刺激基因ISG20和RNA结合蛋白RBM3分别是上调和下调最显著蛋白。2.差异表达蛋白亚细胞结构定位分析显示28.19%的差异蛋白定位于细胞质,26.53%定位于细胞核,13.33%定位于细胞外基质,12.22%定位于质膜。T.marneffei感染的细胞代谢活跃,鉴定到脂质代谢及抗感染相关蛋白。富集分析发现差异表达蛋白主要参与了宿主抗病原体的细胞内I型干扰素反应。3.体外验证实验发现T.marneffei感染巨噬细胞后,巨噬细胞中IRF7、ISG15、STAT1和p-STAT1蛋白表达上调(P<0.05),IFN/STAT1/ISG15信号通路激活。【结论】T.marneffei感染巨噬细胞差异表达蛋白以固有免疫信号通路相关蛋白上调为主,呈现病毒感染相关免疫反应的类似特点,I型干扰素信号与巨噬细胞抗T.marneffei密切相关。T更多.marneffei感染巨噬细胞中STAT1/ISG15信号通路激活,可能参与介导巨噬细胞内脂滴合成,是潜在的脂质代谢调控因子。