胰腺癌是消化道肿瘤中最致命的的恶性肿瘤,且其死亡率与患病率非常接近。胰腺癌发病率与死亡率近年来略有上升,其初始症状不明显、恶化迅速,大多数患者确诊时已属晚期。由于较强的侵袭性和转移性,以及对多种化疗药物的耐药性,即使接受手术切除的胰腺癌患者,其5年生存率也低于10%。癌细胞恶性转移发生于胰腺癌发生发展的早期过程,是导致胰腺癌诊断和治疗困难的主要原因。缺氧是大多数实体瘤的重要特征,它以细胞自主和非细胞自主方式激活癌细胞或肿瘤微环境中其他细胞的信号通路,促进肿瘤恶性进展。癌细胞为了适应缺氧环境,可以通过代谢重编程来维持自身存活与增殖。其中,增强的糖酵解是癌细胞对缺氧作出的代谢反应中最突出的特征,缺氧诱导的这种代谢转换将葡萄糖代谢物从线粒体分流到糖酵解,维持ATP的产生并防止毒性ROS的产生,不但为缺氧癌细胞提供能量来源,而且使癌细胞免于低氧诱导的凋亡,促进癌细胞生存和转移。因此,深入研究参与调节胰腺癌缺氧反应的分子机制,将为胰腺癌未来的治疗提供新的有力靶点。表观转录组学是指发生在编码和非编码RNA上的化学修饰。目前,对这些修饰功能的研究正在兴起,并且已证明这种化学修饰与胚胎干细胞和癌细胞的自我更新以及DNA损伤后的生存密切相关。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是mRNA含量最丰富的内部修饰,由甲基转移酶和去甲基化酶动态调控,并由特定的RNA结合蛋白识别结合发挥调节功能。m6A修饰通过影响mRNA的衰变、剪切、核定位和翻译等,参与许多生物学过程,包括肿瘤的恶性增殖、转移和化疗耐药等。m6A修饰揭示了一种新的致病机制,然而m6A修饰在缺氧胰腺癌中的潜在调控机制知之甚少。HDAC4(histone deacetylase 4)属于Ⅱa类组蛋白去乙酰化酶,参与调控染色质的表观遗传重塑。HDAC家族负责组蛋白赖氨酸残基去乙酰化,通过引起DNA和组蛋白八聚体紧密结合并抑制基因转录,参与调控多种生物学进程,并与许多疾病的发生发展密切相关。此外,HDAC4也可以介导非组蛋白的翻译后修饰,调控其表达以及功能。已有研究表明HDAC4异常高表达与胃癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生发展有关,然而HDAC4在胰腺癌中的生物学意义尚无系统的报道。鉴于此,本课题基于MeRIP-seq和RNA-seq联合分析,主要研究了 m6A修饰在缺氧胰腺癌细胞的生物学意义,并探究了 m6A修饰调控缺氧胰腺癌细胞生物学功能的分子机制。研究内容主要分为以下三个部分:(1)m6A修饰在缺氧胰腺癌细胞中的生物学意义研究:通过Dot blot、m6A定量检测mediolateral episiotomy、qRT-PCR、Western blot及病毒转染等方法,初步明确缺氧胰腺癌细胞中mRNA的m6A修饰水平总体下调,并且该效应主要通过上调去甲基化酶ALKBH5介导;通过MeRIP-seq联合RNA-seq数据分析,发现缺氧条件下胰腺癌细胞中的m6A甲基化修饰改变参与调节基因转录,并可能与缺氧调节的细胞转移和代谢改变有关;细胞外酸化率检测及Transwell等方法进一步明确ALKBH5介导的m6A修饰下调参与调节缺氧诱导的胰腺癌细胞糖酵解代谢和迁移;(2)ALKBH5调节缺氧胰腺癌细胞生物学功能的分子机制研究:通过联合缺氧胰腺癌细胞MeRIP-seq和ALKBH5敲低胰腺癌细胞RNA-seq分析初步筛选出ALKBH5调控的候选靶Erastin基因,并应用qRT-PCR、Western blot等实验明确ALKBH5调控HDAC4的表达;应用MeRIP-qPCR、双荧光素酶报告实验和放线菌素D实验,明确缺氧条件下ALKBH5下调HDAC4的m6A甲基化修饰水平,促进其mRINA的稳定进而调控其表达;通过qRT-PCR、细胞外酸化率检测及Transwell等实验,明确HDAC4促进缺氧诱导的胰腺癌细胞糖酵解和迁移,表明ALKBH5可能是通过调控HDAC4的表达进而调节缺氧诱导的胰腺癌细胞糖酵解代谢和迁移;(3)ALKBH5通过调控HDAC4促进缺氧诱导的胰腺癌细胞糖Pidnarulex作用酵解和迁移:通过构建ALKBH5过表达胰腺癌细胞并抑制HDAC4的表达或活性,检测缺氧条件下糖酵解基因的表达、葡萄糖和乳酸水平以及细胞外酸化率,通过Transwell检测其在缺氧条件下的迁移能力,验证明确ALKBH5通过调控HDAC4促进缺氧诱导的胰腺癌细胞糖酵解和迁移。本研究通过MeRIP-seq联合RNA-seq分析首次揭示了缺氧诱导的胰腺癌细胞中mRNA的m6A修饰景观。缺氧胰腺癌细胞中mRNA的m6A甲基化修饰水平由去甲基化酶ALKBH5介导下调,且与基因转录调节以及缺氧调节的胰腺癌细胞迁移和代谢改变有关。机制上,ALKBH5通过下调HDAC4 m6A甲基化修饰,促进其mRNA稳定性并上调其表达,进而促进胰腺癌细胞糖酵解与迁移。我们的发现有助于阐明缺氧介导胰腺癌进展的新型分子机制,为胰腺癌中缺氧诱导的恶性表型提供了新的见解,并可能为胰腺癌未来的治疗提供新的有力靶点。