多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤,约占癌症死亡人数的2%。异常克隆浆细胞的生长可引起破坏性骨病变、急性肾损伤、贫血和高钙血症。多发性骨髓瘤进展快,多数患者预后差。蛋白酶体在多发性骨髓瘤中高表达,蛋白酶体抑制剂(Proteasomal inhibitors,PIs)已被广泛应用于多发性骨髓瘤的治疗。有报道称蛋白酶体抑制剂除了可诱导多发性骨髓瘤细胞发生凋亡外,还能诱导自噬,但抑制坏死性凋亡的发生。细胞焦亡是一种新类型的细胞死亡方式,而且PIs对MM细胞焦亡尚未报道,具体机制也尚不清楚。因此,本课题将围绕蛋白酶体抑制剂是否以及如何诱导多发性骨髓瘤细胞发生焦亡进行研究,阐述其相关机制。目的:1.研究PIs是否可以引起MM细胞发生焦亡;2Bioactive metabolites.探究PIs诱导MM细胞发生焦亡的类型;3.阐明PIs诱导MM细胞发生焦亡分子机制。方法:1.用PIs处理MM细胞后,使用显微摄影技术观察细胞、钙黄绿素AM/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色、酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)与蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测焦亡相关蛋白。2.收集系PLX5622溶解度列MM细胞,PIs处理后分析Gasdermin(GSDM)家族蛋白变化情况,确定哪个GSDM家族蛋白对于发生焦亡至关重要。3.在PIs处理的MM细胞加入不同半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)抑制剂,WB检测相关蛋白用以探究焦亡发生依赖Caspase的类型。4.用病毒侵染的方法在MM细胞中过表达野生型与其突变体的GSDME,分析其细胞形态以及相关蛋白具体变化。5.通过规律间隔成簇短回文重复序列相关蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR-Cas9)技术敲除MM细胞中的GSDME,之后再回补野生型与其突变体的GSDME,分析其细胞形态以及相关蛋白具体变化。6.构建GSDME活性N端,感染MM细胞后分析其细胞形态以及相关蛋白具体变化。7.用四甲基罗丹明乙酯(Tetramethylrhodamine ethyl ester,TMRE)染色检测线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化。8.ELISA检测培养基细胞色素c(Cytochrome c,Cyto c)。9.用共聚焦拍摄技术分析PIs处理下MM细胞线粒体的变化。10.加入BCL-2抑制剂和包装慢病毒BAX感染细胞,使用显微摄影技术观察细胞形态变化与WB检测焦亡相关蛋白。结果:1.PIs诱导MM细胞发生气球样变,细胞核被PI染成红色,钙黄绿素AM释放增多,绿色荧光减弱,分泌蛋白LDH释放到培养基。2.PIs激活Caspase-3,使得GSDME发生切割,诱导MM细胞焦亡;而Caspase-1没有被PIs激活。3.Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7和Caspase-9抑制剂可以阻断PIs诱导MM细胞焦亡中GSDME的切割。4.PIs不能MK-1775半抑制浓度触发GSDME缺乏的RPMI-8226细胞焦亡,过表达的GSDME的RPMI-8226细胞能被PIs诱导焦亡与LDH释放增多;将GSDME敲除后的OCI-My5和OPM-2细胞焦亡不能被PIs诱导,而PIs处理下重新表达GSDME能诱导细胞发生焦亡。5.N-GSDME能诱导细胞焦亡的发生与LDH的释放增多,同时促进线粒体释放Cyto c到细胞质与培养基,而突变体N-GSDME-T6E不能激活Caspase-9/3促进焦亡的发生。6.PIs触发MM细胞中线粒体的Cyto c释放到细胞质,同时培养基的Cyto c也增多;另外也发现PIs促进MM细胞线粒体的聚集。7.PIs处理MM细胞后,BAX与BCL-2蛋白稳定性没有变化但是结合受到抑制,MMP下降,红色荧光减弱;BCL-2抑制剂能诱导MM细胞焦亡而且增强PIs诱导细胞发生焦亡中GSDME的切割。8.过表达BAX可以促进MM细胞GSDME的激活诱导焦亡的发生,同时LDH的释放量也增多。结论:在本研究中,我们发现PIs以GSDME依赖的方式诱导MM细胞焦亡。值得注意的是,我们发现PIs引发的细胞焦亡都有Caspase-3/6/7/9的参与。此外,PIs可显著降低线粒体膜电位并破坏了BCL-2和BAX的相互作用,诱导Cyto c从线粒体释放到胞浆,并激活GSDME;GSDME的N端过表达足以让线粒体释放Cyto c并激活Caspase-9/3,提示N-GSDME可能穿透线粒体膜。BCL-2抑制剂和BAX能以GSDME依赖的方式诱导MM细胞焦亡。根据这些发现,抑制BCL-2与PIs协同作用可进一步诱导MM细胞发生焦亡。