目的:经前期研究证明,雷帕霉素预处理MDSC(骨髓源性免疫抑制细胞)分泌的外泌体(Rapa-Exo)可有效延缓角膜移植排斥反应。但其作用机制尚不清楚。本研究的目的为进一步探讨雷帕霉素预处理MDSC分泌的外泌体延缓角膜移植免疫排斥的作用机制。方法:(1)MDSC来源的Exo分离与鉴定:选取正常8周龄BALB/c小鼠,提取其骨髓细胞,通过免疫磁珠分选法分选骨髓细胞中的MDSC,加入Rapa(100nmol/L)培养2天收集上清,通过超速离心法提取培养上清液中的Exo,并通过透射电镜及WB鉴定Exo。(2)验证miR-181d-5p在细胞、外泌体及角膜中的表达量:选取正常8周龄BALB/c小鼠,提取其骨髓细胞,通过免疫磁珠分选法分选骨髓细胞中的MDSC,将MDSC分为Nor组和Rapa组。Rapa组加入Rapa(100nmol/L)。两组MDSC培养2天收集细胞及细胞上清,细胞上清通过超速离心法提取培养上清液中的Exo。提取两组细胞及Exo中的RNA。建立同系小鼠穿透性角膜移植和异系小鼠穿透性角膜移植模型,待异系移植小鼠角膜发生排斥后取下眼球,此时将同系移植小鼠未排斥角膜取下,以正常同龄小鼠眼球作为对照,提取角膜RNA。经PCR检测细胞、外泌体和角膜组织中miR-181d-5p的表达量。(3)构建穿透性角膜移植模型及高表达miR-181d-5p的Rapa-Exo干预治疗与效果评价:建立小鼠异系穿透性角膜移植模型,随机分为Allo+PBS组、Allo+Rapa-Exo组、Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组。术后三天开始结膜下注射,Allo+PBS组结膜下注射PBS溶液;Allo+Rapa-Exo组结膜下注射Rapa-Exo,浓度为100μg/ml;Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组结膜下注射Rapa-Exo和miR-181d-5p antagomir,Rapa-Exo浓度为100μg/ml,miR-181d-5p antagomir浓度为1000μg/ml,剂量均为10μl/次,3天1次,共注射3次。每隔一天用裂隙灯给小鼠术眼拍照观察小鼠植片排斥情况,观察30天,根据植片排斥时间绘制生存曲线。术后23天,取以上3组角膜,进行HE染色比较各组植片炎症反应情况。经PCR检测角膜组织中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α、Ccr7和IL-17α的表达量。(4)巨噬细胞的分离以及与Exo共培养:选取正常8周龄BALB/c小鼠,提取其骨髓细胞,加入m-csf刺激因子培养至第6天,将巨噬细胞分为四组,正常组(Nor组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+Rapa-Exo组(LPS+Rapa-Exo组)、脂多糖+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组(LPS+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组)。各组细胞加入刺激后培养24h收集细胞、培养48h收集细胞上清。将收集的细胞提取RNA后,经过Real time PCR法检测细胞中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α的表达水平。用ELISA试剂盒检测细胞上清炎症因子IL-6和TNF-α蛋白水平。(5)Mi R-181d-5p靶基因预测:通过四种不同的网站进行miR-181d-5p靶基因的预测,分别是miRDB、Target Scan、RNA22和Starbase。Target Scan获得大鼠、小鼠和人的miR-181d-5p与KLF6结合位点及序列。双荧光素酶报告基因检测mmumiR-181d-5p与KLF6能否相互作用。(6)巨噬细胞与si KLF6共培养:依据上述(4)中的方法将巨噬细胞培养至第六天,将细胞分为三组,正常组(Nor组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+si KLF6组(LPS+si KLF6组)。各组细胞加入刺激后培养24h收集细胞(细胞1),培养48h收集细胞(细胞2)及培养上清。提取细胞1中的RNA,经Real time PCR法检测细胞中的炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α和klf6的表达水平。提取细胞2中的蛋白,经蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组klf6的表达量。用ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-6和TNFα的表达水平。(7)构建穿透性角膜移植模型及si KLF6的干预治疗与效果评价:建立小鼠异系穿透性角膜移植模型,随机分为Allo+PBS组、Allo+si KLF6组,术后3天开始结膜下注射si KLF61(000μg/ml),剂量10μl,3天1次,共注射3次。每隔一天用裂隙灯给小鼠术眼拍照观察小鼠植片排斥情况,观察30天,根据植片排斥时间绘制生存曲线。术后Ceralasertib作用20天,取以上两组角膜,行HE染色观察比较两组角膜炎症反应情况。经PCR检测角膜组织中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α的表达量。结果:(1)MDSC来源的外泌体鉴定:提取的外泌体通过100kv进行电镜检测成像,形态为一侧或双侧凹陷的盘状囊泡,直径主要集中在180nm,分布范围在50～200nm之间。WB结果显示外泌体CD81、CD9结果阳性。结果说明成功提取外泌体。(2)Mi R-181d-5p在细胞、外泌体及角膜中的表达差异:Real time PCmedicinal marine organismsR法检测结果可知,Rapa预处理的MDSC及其分泌的外泌体中miR-181d-5p表达量高于未处理组的MDSC及其分泌的外泌体。在角膜组织中,异系排斥组的角膜miR-181d-5p表达量低于正常组和同系未排斥角膜。(3)Mi R-181d-5p体内实验观察:三组小鼠角膜移植模型中,各组小鼠角膜植片平均存活时间分别为Allo+PBS组(18.9±5.8)d、Allo+Rapa-Exo组(25.4±6.0)d、Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组(17.1±3.8)d。Allo+Rapa-Exo组的存活时间显著高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。各组角膜HE染色Allo+PBS组与Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组炎症反应较重,Allo+Rapa-Exo组角膜炎症反应较轻。Real time PCR法检测各组植片中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α的表达量,发现Allo+PBS组与Allo+Rapa-Exo+miR-181d-5p antagomir组明显高于Allo+Rapa-Exo组(P<0.05)。(4)上调miR-181d-5p在巨噬细胞的作用:四组巨噬细胞,经Real time PCR检测,不做任何处理的Nor组炎症因子表达水平最低,LPS组与LPS+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组的炎症因子表达水平无统计学差异且明显高于LPS+Rapa-Exo组(P<0.05)。ELISA检测细胞培养上清,炎症因子表达水平与Real time PCR结果一致。免疫荧光发现klf6的表达水平Nor组最低,LPS组与LPS+Rapa-Exo+miR-181d-5p inhibitor组表达量最高且无统计学差确认细节异,同时高于LPS+Rapa-Exo组。表明上调miR-181d-5p可明显降低巨噬细胞炎症因子的表达量,即miR-181d-5p具有抑制巨噬细胞炎症反应的作用。(5)靶基因生物信息学分析:在四种不同的网站miRDB、Target Scan、RNA22和Starbase均预测KLF6是miR-181d-5p的靶基因。Target Scan是最早出现的miRNA靶基因软件,也是目前使用率和准确性最高的预测软件,通过该软件获得miR-181d-5p与KLF6在大鼠、小鼠和人的结合位点及序列。双荧光素酶报告基因检测mmu-miR-181d-5p可与KLF6的启动子结合。(6)si KLF6转染巨噬细胞:通过Real time PCR法检测细胞IL-6、IL-12、IL-1β及TNF-α表达量,三组巨噬细胞炎症因子的表达水平由强到弱依次为LPS组、LPS+si KLF6组、Nor组。通过ELISA检测细胞上清中IL-6、TNF-α蛋白水平以及用Western Blot检测KLF6的蛋白水平,结果与Real time PCR一致。(7)si KLF6的体内实验:两组小鼠角膜移植模型中,各组小鼠角膜植片存活时间分别为Allo+PBS组(18.2±7.0)d,Allo+si KLF6组(27.7±6.4)d。Real time PCR检测各组植片中炎症因子IL-6、IL-12、IL-1β、TNF-α及KLF6的表达量,Allo+si KLF6组明显低于Allo组。结论:(1)雷帕霉素预处理的MDSC分泌的外泌体具有延缓角膜移植免疫排斥反应的作用。(2)Mi R-181d-5p以klf6为作用靶点抑制巨噬细胞炎症反应并延缓角膜移植排斥反应。