目的:人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是常见的性传播感染病毒。HPV与疾病和癌症的发生密切相关,包括肛门生殖器疣、复发性呼吸道乳头状瘤病,以及肛门生殖器和口咽癌,造成了严重的疾病负担。HPV感染的皮肤表现主要是皮肤疣和生殖器疣,该病可能会影响日常活动,导致疼痛和危害患者精神心理健康。免疫疗法(如温热疗法)等较新的治疗方法在免疫性疾病中起到重要作用。温热已被成功用于治疗病毒疣和高危型HPV引起的宫颈上皮内瘤变,并且,相较传统激光、冷冻等方法,温热疗法具selleck LXH254有疼痛率低、适用人群广、复发率低等优点。本研究集中研究温热影响HPV阳性细胞的死亡的作用,从而深入探究局部温热对HPV感染的清除作用,为温热治疗病毒疣提供一定的理论基础。研究方法:研究采用HPV阳性细胞系(SiHa细胞、CaSki细胞)和尖锐湿疣组织作为研究对象,尖锐湿疣组织收集自门诊就诊要求切除疣体的患者。细胞和疣体组织温热方式均为44(±0.1)℃水浴加热30分钟。1、为了研究温热是否引起HPV阳性细胞免疫原性死亡,我们针对未温热和温热的SiHa细胞、CaSki细胞进行免疫原性死亡相关标志物的检测,包括热休克蛋白HSPA6、高迁移率族蛋白HMGB1、钙网蛋白CRT,细胞外ATP和线粒体DNA。2、研究温热对细胞状态包括细胞凋亡和细胞周期的影响。研究温热和TLR4抑制剂TAK-242联合治疗对细胞周期蛋白和细胞凋亡蛋白p21的作用。3、通过对患者尖锐湿疣组织的单细胞测序数据分析,在组织水平验证温热前后相关蛋白的变化。结果:1、44℃温热引起HPV阳性细胞免疫原性死亡。温热后6小时起,SiHa细胞、CaSki细胞内总HSPA6表达增加,至24小时仍维持至高水平。温热前后,SiHa和CaSki细胞总HMBG1不变,CaSki细胞在温热后24小时出现细胞外释放,而SiHa细胞温热后1小时、24小时细胞外HMGB1水平均未见增加。温热不影响SiHa和CaSki细胞内总钙网蛋白表达,但温热后24小时,流式分析显示,SiHa和CaSki细胞膜表面表达增加。与未温热细胞相比,温热后1小时SiHa和CaSki细胞的上清液ATP释放未见增加,温热后24小时细胞上清液ATP水平增加。相较未处理细胞,温热处理的SiHa细胞在1小时后线粒体DNA水平增高,而温热处理的CaSki细胞在24小时后发现线粒体DNA表达增高。2、温热诱导细胞凋亡,44℃温热处理30分钟的SiHa和CaSki细胞均在温热后24小时均出现BYL719体内早期凋亡细胞增多。温热后24小时,SiHa和CaSki细胞出现细胞周期阻滞,具体表现为G1期细胞比例减Biorefinery approach少,G2/M期细胞比例增多。44℃温热后1小时、6小时,与未处理细胞相比,p21蛋白在SiHa和CaSki细胞中均表达增多。温热联合TLR4抑制剂处理的SiHa和CaSki细胞与单一温热疗法的细胞相比,联合治疗的SiHa和CaSki细胞HSPA6表达降低,p53表达升高,p21表达增加,早期凋亡细胞比例增多。在温热基础上,小干扰RNA敲低HSPA6,p21水平提升;小干扰RNA敲低p53,p21水平降低。结论:1、温热诱导HPV阳性细胞免疫原性死亡,表现为温热后HSPA6水平升高、HMGB1和ATP细胞外释放、CRT膜表达增高和线粒体DNA水平升高。2、温热联合TLR4抑制剂治疗通过降低HSPA6蛋白表达、增加p53蛋白表达来加剧p21依赖的细胞凋亡。