沙门菌是一种重要的人兽共患病病原菌,严重威胁动物和人类健康。该菌在宿主体内能免疫逃逸,进而能在体内持续存在,但此机制尚不清晰。巨噬细胞是沙门菌全身性感染的主要载体,沙门菌在巨噬细胞中持续存活是其在宿主体内持续存在的基础。沙门菌侵入巨噬细胞后,在沙门菌囊泡(SCV)内生存复制,该特性受Ⅲ型分泌系统2(T3SS2)调控。T3SS2的针形复合体是沙门菌转运效应蛋白至宿主细胞胞浆的通道。然而目前关于T3SS2的针形复合体对沙门菌在巨噬细胞内持续存在的影响研究较少。前期研究中发现肠炎沙门菌C50041ΔspiC在巨噬细胞内持续增殖,进而诱导胞内高水平IL-10。本研究以C5004LEE011作用1ΔspiC为参照,聚焦于T3SS2针形复合体内三个代表性基因ssaJ、ssaV和ssaG,研究 C50041ΔssaJ、C50041ΔssaV和 C50041ΔssaG 三株缺失株在巨噬细胞内的持续性,并分析三株缺失株在巨噬细胞内持续存在与SCV完整性的关系,以阐述沙门菌在巨噬细胞内持续存在和T3SS2针形复合体的关联性。1.ssaJ、ssaV、ssaG缺失株的构建和生物学特性根据同源重组的原理,构建C50041ΔssaJ、C50041ΔssaV和C50041ΔssaG,并对这三株缺失株的生物学特性进行探究。与亲本株C50041相比,三株缺失株的生长生化特性没有发生改变,生物膜形成能力及运动能力也无显著差异。沙门菌感染巨噬细胞实验结果显示,与亲本株C50041相比,三株缺失株的黏附和侵袭能力没有显著差异;三株缺失株的胞内增殖能力显著增强,其感SAHA IC50染巨噬细胞后在42 h仍具有较高的增殖潜能;同时诱导胞内高水平的IL-10,这一现象与spiC缺失株特性一致。qPCR检测结果显示,三株缺失株感染巨噬细胞,胞内促炎因子IFN-γ、iNOS和SOCS3的表达水平下调,抑炎因子IL-10和Arg-1的表达水平显著上调。LDH实验结果显示,与C50041相比三株缺失株感染巨噬细胞后第5h和8h细胞毒性均显著降低。胞外逃逸实验显示,与C50041相比,三株缺失株在巨噬细胞中逃逸能力显著下降。体内实验显示,与C50041相比,三株缺失株的LD_(50)上升超过1,500倍;体内动态分析显示,三株缺失株在脾脏和肝脏均不定殖;ELISA检测结果显示,与C50041相比,三株缺失株感染小鼠第14 d,小鼠血清中IL-10的表达水平上调,这表明三株缺失株毒性均显著降低。2.ssaJ、ssaV和ssaG缺失株感染巨噬细胞后对SCV完整性的影响沙门菌侵入巨噬细胞后在SCV内生存复制,SCV完整性对沙门菌胞内持续很重要,SifA与SCV的完整性密切相关,因此进一步分析SifA蛋白表达及SCV完整性。TEM-1报告系统显示,ssaJ、ssaV和ssaG三株缺失株不影响效应蛋白SifA的转运。使用激光共聚焦显微镜观察三株缺失株与SCV的共定位,结果显示与C50041相比,ssaJ、ssaV和ssaG三株缺失株与SCV的共定位均更多。C50041与SCV的共定位占12.75%,ssaJ、ssaV和ssaG三株缺失株与SCV共定位比分别是36.70%、33.90%,26.73%。LLO能破坏SCV膜,进一步构建LLO重组沙门菌。胞内菌载量分析显示,重组菌在5 h增殖能力高于缺失株,在20 h增殖能力显著低于缺失株。重组菌C50041ΔssaJ::LLO与SCV的共定位显著少于C50041和C50041AssaJ与SCV的共定位,重组菌与SCV的共定位占比下调至5.88%。通过TEM-1报告系统和Western Blot分析ssaJ、ssaV和ssaG三株缺失株对效应蛋白SpiC在巨噬细胞内转运及在缺失株中表达的影响,结果显示SpiC不分泌至胞浆中,但可在缺失株dental pathology中表达,表明这些基因缺失导致T3SS2针形复合体不完整,不能发挥转运T3SS2效应蛋白的功能。综上所述,本研究构肠炎沙门菌ssaJ、ssaV及ssaG三株缺失株,与野生株C50041相比,三株缺失株均能在巨噬细胞内持续存在,并诱导胞内高水平的IL-10,对小鼠毒力显著减弱。与野生株C50041相比,ssaJ、ssaV和ssaG三株缺失株与SCV共定位更多,这三个缺失株不影响SifA胞浆内转运和表达,但影响SpiC不能转运至胞浆。这些结果表明,T3SS2针形复合体能够介导沙门菌胞内持续感染,沙门菌在胞内持续存在与SCV完整性及SpiC的分泌密切相关。本研究拓宽了对T3SS2针形复合体的了解,为沙门菌的防控带来新思路。