研究目的:骨骼肌是高度可塑的异质性组织,根据其收缩特性和代谢特征,可以将骨骼肌分为依靠线粒体有氧氧化供能的慢肌纤维和依靠糖酵解代谢供能为主的快肌纤维。骨骼肌的收缩特性与代谢特征是相互耦合的,慢肌纤维相关基因表达增加同时会促进线粒体生物合成和提高线粒体氧化磷酸化能力,使线粒体的氧化磷酸化代谢更加匹配慢肌纤维。肌纤维类型受到表观遗传的调控,表观遗传修饰H3K27me3参与调控肌纤维类型,表观酶JMJD3是H3K27me3的特异性去甲基化酶,但其在调控肌纤维类型转化过程中的机制还不清楚。本研究以C2C12细胞为研究对象,通过siRNA干扰JMJD3表达和质粒转染过表达JMJD3,来观察线粒体生物合成、线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)和快慢两类肌纤维表型相关基因的表观遗传修饰变化及相关蛋白表达。初步探讨表观酶JMJD3在调控成肌分化过程中线粒体-肌球蛋白重链亚型的偶联机制研究。研究方法:本研究选取C2C12细胞为实验对象,共分为对照组(MOCK)、JMJD3抑制组(JMJD3-siRNA)、空质粒组(pc DNA3.1(+)-3x FLAG)、JMJD3过表达组(pc DNA3.1(+)-Kdm6b-3x FLAG)。经实验摸索确定了siRNA转染效率,转染干预2天后分化3天。使用JC-1探针法检测线粒体膜电位变化ΔΨ,用DCFH-DA探IACS-010759生产商针法检测细胞ROS生成水平,Western-blotting实验方法检测线粒体生物合成相关蛋白PGC-1α、COXⅣ;UPRmt相关蛋白ATF5、Hsp 60、Clp P;肌纤维类型相关蛋白MYH4、MYH7的蛋白表达水平。染色质免疫沉淀(CHIP)检测ATF5、PGC-1α、MYH4和MYH7基因启动子处转录抑制性组蛋白H3K27me3的富集情况。研究结果:(1)JMJD3对C2C12细胞线粒体生物合成和UPRmt相关蛋白表达的影响与Mock组相比,sexudative otitis mediaiRNA-JMJD3组线粒体生物合成相关蛋白PGC-1α和COXⅣ蛋白表达显著降低(p<0.05)。siRNA-JMJD3组UPRmt相关蛋白ATF5和Hsp60蛋白表达显著降低(p<0.05),Clp P蛋白表达出现下降趋势,但并无显著差异。与空质粒组相比,JMJD3过表达组线粒体生物合成相关蛋白PGC-1α和COXⅣ蛋白表达显著升高(p<0.05)。JMJD3过表达组UPRmt相关蛋白ATF5和Hsp60表达显著升高(p<0.05),而Clp P有升高趋势但无显著差异。(2)JMJD3对C2C12细胞线粒体功能的影响与Mock组相比,siRNA-JMJD3组线粒体膜电位显著性降低(p<0.01)。与Mock组相比,siRNA-JMJD3组细胞ROS显著性升高(p<0.05)。与空质粒组相比,JMJD3过表达组线粒体膜电位无显著变化。与空质粒组相比,JMJD3过表达组ROS显著性升高(p<0.05)。(3)JMJD3对C2C12细胞肌纤维表型相关蛋白表达的影响与Mock组相比,siRNA-JMJD3组MYH7蛋白(慢肌纤维)表达显著性降低(p<0.05),而MYH4蛋白(快肌纤维)表达显著性升高(p<0.05)。与空质粒组相比,JMJD3过表达组MYH4蛋白表达显著降低(p<0.05),与空质粒组相比JMJD3过表达组MYH7蛋白表达显著升高(p<0.05)。(4)JMJD3对C2C12细胞线粒体生物合成、UPRmt和快慢肌表型相关基因H3K27me3修饰的影响与Mock组相比,siRNA-JMJD3干扰C2C12细胞后Apoptosis抑制剂UPRmt激活关键转录因子ATF5基因启动子处H3K27me3富集率无显著性变化。siRNA-JMJD3干扰C2C12细胞后线粒体生物合成关键转录因子PGC-1α基因启动子处H3K27me3富集率呈升高趋势但无显著性变化。siRNA-JMJD3干扰C2C12细胞后慢肌纤维相关基因MYH7基因启动子处H3K27me3富集率无显著性变化。siRNA-JMJD3干扰C2C12细胞后快肌纤维相关基因MYH4基因启动子处H3K27me3富集率显著降低(p<0.05),MYH4基因转录活性激活。与空质粒组相比,JMJD3过表达质粒转染C2C12细胞后UPRmt激活转录因子ATF5基因启动子处H3K27me3富集率显著降低(p<0.05),ATF5基因转录活性激活。JMJD3过表达质粒转染C2C12细胞后线粒体生物合成关键激活转录因子PGC-1α基因启动子处H3K27me3富集率显著降低(p<0.05),PGC-1α基因转录活性激活。JMJD3过表达质粒转染C2C12细胞后慢肌纤维相关基因MYH7基因启动子处H3K27me3富集率显著降低(p<0.05),MYH7基因转录活性激活。JMJD3过表达质粒转染C2C12细胞后快肌纤维相关基因MYH4基因启动子处H3K27me3富集率显著升高(p<0.05),MYH4基因转录活性受到抑制。研究结论:1.表观酶JMJD3一方面通过降低线粒体生物合成和UPRmt相关基因上转录抑制性组蛋白H3K27me3富集率,促进线粒体生物合成与UPRmt相关基因的表达,增强线粒体功能;表观酶JMJD3另一方面通过降低慢肌肌球蛋白重链亚型相关基因上转录抑制性组蛋白H3K27me3富集率,促进慢肌肌球蛋白重链亚型蛋白表达增多。JMJD3可能通过调控相关基因表观遗传修饰H3K27me3来偶联肌球蛋白重链亚型和线粒体功能。