背景宫颈癌Hepatic organoids是女性最常见癌症之一。世界范围内宫颈癌的发病率在女性常见癌症中位居第三位。超过99%的癌前病变与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染有关,尤其是高危型(highrisk,HR)HPV 16,18,31,33和45,在宫颈癌患者中的检出率约为97%。据报道,全世界超过70%的宫颈癌患者都存在HPV 16和18型的感染。目前HPV相关疫苗的研发和使用有效控制了 HPV新发感染。然而,HPV疫苗的应用和普及仍然受限,在美国等国家,仅有不到40%的适龄女性接种HPV疫苗,而男性接种率几乎为零。另外,许多发展中国家不能承受疫苗的价格。更为重要的是,该疫苗仅能预防HPV感染,而针对已经感染或者已经罹患宫颈癌的患者尚无有效的治疗方法。因此,HPV相关疾病,仍然是我国乃至全世界面临的一项重大公共卫生问题。HPV阳性癌细胞的生长依赖于癌基因E6的持续表达,许多研究表明E6癌蛋白是维持HPV阳性癌细胞恶性表型的关键因素。E6可以通过降解p53从而规避细胞检查点,引发不受控制的细胞恶性增殖,最终使细胞转变为癌细胞。然而,p53降解并不能完全解释HPV16 E6诱导的细胞恶性转化。因此寻找HPV致癌机制的新靶点十分必要。代谢异常对多种肿瘤的发生发展起促进作用。在肿瘤细胞中,糖酵解经常被过度激活。高通量的糖酵解不仅为肿瘤恶性增殖提供能量,也为肿瘤细胞内的生物合成提供原料。磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)是糖酵解的分支,分为氧化阶段和非氧化阶段。其中非氧化PPP主要负责产生5-磷酸核糖(ribose 5-phosphate,R5P),还可间接产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)。R5P 是合成核酸和氨基酸的生物前体,在调节癌细胞代谢和增殖、DNA损伤反应中发挥着重要作用;NADPH为肿瘤的生物合成提供原料,并可降低肿瘤细胞内的氧化应激水平。因此非氧化购买MCC950PPP的激活对于快速增殖的肿瘤细胞至关重要。然而,目前尚未有研究阐明非氧化PPP在HPV相关细胞转化和肿瘤发展中的作用。目的探究HPV16 E6激活非氧化PPP促进宫颈癌细胞恶性增殖的作用机制,检测转酮醇酶(transketolase,TKT)抑制剂氧硫胺素(oxythiamine,OT)在治疗HPV阳性肿瘤和恢复化疗敏感性的作用。方法1.HPV16 E6通过激活TKT促进宫颈癌细胞增殖(1)利用慢病毒载体构建异位表达HPV16 E6的宫颈癌细胞系(C33A-E6),并通过Western blot和RT-qPCR检测HPV16 E6的蛋白和mRNA水平。(2)通过CCK8和克隆形成实验检测HPV16 E6对宫颈癌细胞增殖能力的影响,并进一步通过裸鼠成瘤实验在体内验证HPV16 E6对宫颈癌生长的影响。(3)通过非靶向代谢组学鉴别出HPV感染后显著改变的代谢产物;通过生物信息学筛选出HPV阳性宫颈癌组织和HPV阴性宫颈癌旁组织中的差异表达基因,并进一步通过GO分析和KEGG富集分析确定这些差异表达基因所发挥的生物学功能。(4)通过Western blot和RT-qPCR检测HPV16 E6对TKT蛋白和mRNA水平的影响;通过分光光度法检测HPV16 E6对TKT酶活性的影响。(5)通过CCK8、克隆形成和EdU检测加入TKT抑制剂OT后对宫颈癌细胞增殖和DNA合成能力的影响,并进一步通过裸鼠成瘤实验检测OT治疗后对肿瘤生长的影响。2.HPV16 E6通过激活AKT上调TKT酶活性促进宫颈癌细胞增殖(1)通过Western blot检测HPV16 E6对AKT和p-AKT蛋白水平的影响。(2)通过 Western blot检测加入 AKT 抑制剂 TCN 后,HPV16 E6 对 AKT、p-AKT和TKT蛋白水平的影响;通过分光光度法检测加入TCN后,HPV16 E6对TKT酶活性的影响。(3)通过CCK8、克隆形成和EdU检测加入TCN后,HPV16E6对宫颈癌细胞增殖和DNA合成的影响。3.TKT抑制剂在HPV阳性宫颈癌治疗及恢复化疗耐药的作用(1)通过CCK8检测单独加入OT或DDP或联合加入OT和DDP对宫颈癌细胞活力的影响。(2)通过裸鼠成瘤实验检测的单独加入OT或DDP或联合OT和DDP治疗对肿瘤生长的影响;通过IHC染色检测不同给药方案对移植瘤组织中PCNA和Ki67蛋白水平的影响。结果1.HPV16 E6通过激活TKT促进宫颈癌细胞增殖(1)与空载对照组相比,C33A-E6组细胞中HPV16 E6蛋白和mRNA水平显著增加。(2)与空载对照组相比,C33A-E6组细胞的活力和克隆形成能力显著增加;裸鼠成瘤实验结果显示,与溶剂对照组相比,C33A-E6组小鼠肿瘤的体积和重量增加。(3)与空载对照组相比,HPV感染后导致非氧化PPP代谢产物显著增加;通过TCGA数据库筛选发现,所选数据集中,HPV阳性宫颈癌组织和HPV阴性宫颈癌旁组织中共有91个差异表达基因,这些差异表达基因主要富集在DNA合成、核苷酸代谢和嘌呤合成等代谢通路。(4)与空载对照组相比,C33A-E6组细胞的TKT蛋白水平和mRNA水平没有显著增加,但TKT酶活性显著增加。(5)与C33A-E6组相比,C33A-E6+OT组细胞的活力、克隆形成能力和DNA合成能力明显下降;通过裸鼠成瘤实验结果显示,与C33A-E6组相比,C33A-E6+OT组小鼠肿瘤的体积和重量减小。2.HAlisertibPV16 E6通过激活AKT上调TKT酶活性促进宫颈癌细胞增殖(1)与空载对照组相比,293T-E6和C33A-E6组细胞中p-AKT蛋白水平显著增加。(2)与 293T-E6 和 C33A-E6 组相比,293T-E6+TCN 和 C33A-E6+TCN 组细胞中p-AKT蛋白水平显著降低,TKT酶活性显著降低,但TKT蛋白水平没有显著改变。(3)与C33A-E6组相比,C33A-E6+TCN组细胞的活力、克隆形成能力和DNA合成能力明显下降。3.TKT抑制剂在HPV阳性宫颈癌治疗及恢复化疗敏感性的作用(1)与溶剂对照组相比,C33A-E6+OT或C33A-E6+DDP组细胞的活力降低,C33A-E6+OT+DDP组细胞的活力进一步降低。(2)与溶剂对照组相比,C33A-E6+OT或C33A-E6+DDP组小鼠肿瘤体积和重量降低,C33A-E6+OT+DDP组小鼠肿瘤体积和重量进一步降低;通过IHC染色发现,与C33A-E6组相比,C33A-E6+OT或C33A-E6+DDP组小鼠肿瘤组织中PCNA和Ki67蛋白表达降低,C33A-E6+OT+DDP组小鼠肿瘤组织中PCNA和Ki67蛋白表达进一步降低。结论1.HPV16 E6通过激活AKT上调TKT酶活性从而促进宫颈癌细胞增殖。2.OT可一定程度上抑制HPV阳性宫颈癌生长,与DDP联合使用可进一步增强DDP的抑瘤作用。科学价值本实验阐明了 HPV感染导致宫颈癌细胞增殖的作用及机制,明确了 HPV感染后代谢的改变可促进宫颈癌细胞的恶性增殖,这不仅为HPV相关疾病研究以及宫颈癌的治疗提供了新策略,还为开发有效的宫颈癌治疗药物提供理论依据和实验基础。