实验目的:通过观察真武汤对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心力衰竭心肌细胞的相关指标的影响,及对电压门控钾(Voltage-gated potassium,Kv)通路相关蛋白表达、瞬时外向钾电流(Transient outward potassium current,I_(to))的影响,探究真武汤经I_(to)/Kv通路对心力衰竭心肌细胞电重构的影响,揭示真武汤治疗心力衰竭及相关心律失常的机制,为心衰的治疗提供新的思路。实验方法:1.12只SPF级SD雄性大鼠,随机取5只连续灌服真武汤颗粒剂一周,最后一天灌胃1h后从腹主动脉取血制成含药血清保存备用。另取7只正常SD大鼠制备空白血清,大鼠灌服等量蒸馏水,连续7d,余步骤方法同上。再将H9c2大鼠心肌细胞培养于完全培养基,当细胞生长密度达80%～90%时进行传代,取生长对数期细胞开展后续实验。2.用不同浓度AngⅡ、SIM、Ba Cl_2及不同体积分数的真武汤含SCH772984 molecular weight药血清作用于模型组心肌细胞,用CCK-8法检测心肌细胞增殖情况,筛选出最佳药物浓度。3.根据药物浓度筛选的结果,将细胞分为七组:(1)对照组(N):10%空白血清+90%DMEM-H;(2)模型组(M):AngⅡ+10%空白血清+90%高糖培养基(DMEM-H);(3)低浓度真武汤含药血清组(Z1):AngⅡ+真武汤2%含药血清+8%空白血清+90%DMEM-H;(4)中浓度真武汤含药血清组(Z2):AngⅡ+真武汤4%含药血清组+6%空白血清+90%DMEM-H;(5)高浓度真武汤含药血清组(Z3):AngⅡ+真武汤8%含药血清组+2%空白血清+90%DMEM-H;(6)诱导剂组(YD):AngⅡ+辛伐他汀(Simvastatin,SIM)+10%空白血清+90%DMEM-H;(7)抑制剂组(YZ):AngⅡ+氯化钡(Barium chloride,Ba Cl_2)+10%空白血清+90%DMEM-H。4.用相差显微镜在固定倍数下观察细胞形态,每孔随机捕获5个视野,每个视野随机选取5个细胞,观察细胞形态学变化,用Image J软件测量单个细胞表面积,取各组平均值分析;然后收集各组细胞提取液,每组设置3个复孔,按照大鼠心钠肽(Atrial natriuretic cpeptide,ANP)ELISA试剂盒说明书操作,计算ANP浓度。5.确定造模成功后,用Western Blot法检测Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、DPP6、KCh IP2蛋白的表达情况,实时荧光定量PCR法检测Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、DPP6、KCh IP2的m RNA相对表达,观察趋势。6.收集各组细胞,裂解后取上清液,每组设置3个复孔,按照钾测试盒说明书操作,计算钾离子浓度。再用全细胞膜片钳技术检测I_(to),观察各组细胞电流密度、峰值电流、激活电压及电流、失活电压及电流,绘制I-V曲线、稳态激活曲线、稳态失活曲线。实验结果:1.经AngⅡ诱导后,心肌细胞相对表面积增大,细胞提取液中ANP含量及ANP m RNA显著升高,提示造模成功;2.与对照组相比,模型组心肌细胞Kv1.4蛋白表达水平明显上升,而Kv4.2、Kv4.3、DPP6、KCh IP2蛋白表达水平明显下降;与模型组相比,随着真武汤剂量增加,心肌细胞Kv1.4蛋白表达水平呈下降趋势,而Kv4.2、Kv4.3、DPP6、KCh IP2蛋白表达水平呈上升趋势,以真武汤高剂量组效果最为明显;3.与对照组相比,模型组心肌细胞Kv1.4 m RNA水平显著上升;与模型组相比,真武汤低、中、高剂量组Kv1.4 m RNA水平显著下降,且随剂量的升高而逐渐降低。而模型组Kv4.2、Kv4.3、DPP6、KCh IP2的m RNA表达水平与对照组相比明显下降;与模型组相比,真武汤低、中、高剂量组Kv4.2、Kv4.3、DPP6、KCh IP2的m RNA表达显著升高,且随剂量的升高而逐渐升高。4.与对照组相比,模型组心肌细胞钾离子浓度明显下降;与模型组相比,低、中剂量真武汤组含药血清能够使细胞内钾离子浓度升高。5.与对照组相比,真武汤组I_(to)峰值电流、电流密度明显上升,并可以减缓I_(to)的失活。实验结论:1.真武汤可以通过改善Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KCh IP2、DPP6蛋白表达趋势及m RNA从而调控Kv通路Clinical forensic medicine,逆转心肌细胞肥大,改善心功能;2.真武GSK2118436 IC50汤可以通过调节细胞内外的K~+浓度使钾离子外流增加,诱导I_(to),增加其峰值电流,减缓I_(to)失活,这可能是其调节电重构、治疗心力衰竭及相关心律失常的机制之一。