目的:本研究结合体外实验、体内实验、基因芯片及生物信息学方法,在三阴乳腺癌(Triplenegative breast cancer,TNBC)细胞系 MDA-MB-23 Microbiology抑制剂1 中沉默核受体结合 SET 结构域蛋白 2(NSD2,nuclear receptor-binding SET domain protein 2)的表达,观察NSD2对TNBC细胞生物学特性的影响,探讨NSD2在TNBC细胞失巢凋亡抵抗和转移中可能发挥的作用和机制。方法:通过使用超低粘附细胞培养板悬浮培养48h、悬浮后重贴壁24h的不同培养条件,建立动态模拟三阴乳腺癌MBMS-354825DA-MB-231细胞失巢后转移模型,应用Realtime PCR、Western Blot实验检测对照组细胞、失巢状态细胞、失巢凋亡抵抗细胞中NSD2 mRNA及蛋白表达水平。通过慢病毒转染shRNA及嘌呤霉素筛选,构建稳定沉默NSD2表达的细胞株。使用Calcein-AM/EthD-Ⅰ双染法、Hoechst凋亡实验(33258)、CCK-8细胞增殖实验、细胞平板克隆实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验检测沉默NSD2表达后失巢状态培养后TNBC细胞生物学行为。采用基因微阵列技术检测沉默NSD2表达后MDA-MB-231细胞基因表达谱的变化,研究差异明显的基因,利用DAVID工具对差异基因进行KEGG信号通路富集分析,筛选细胞凋亡相关基因。用Western Blot免疫印迹实验分析沉默NSD2表达对失巢培养条件下后TNBC细胞中死亡受体及凋亡相关蛋白表达的影响。建立TNBC转移模型,Realtime PCR检测裸鼠肺部组织中人类基因组中特异性的Alu序列,评估肿瘤微转移情况。利用UALCAN数据库中肿瘤基因组图谱(源于TCGA)对乳腺癌组织、三阴乳腺癌组织及正常对乳腺组织中的NSD2及死亡受体基因的差异表达进行分析;下载GEO数据集,对TNBC及其转移灶中的NSD2及死亡受体基因的差异性表达进行分析;Kaplan-Meier plotter数据库分析NSD2及死亡受体基因表达在TNBC中的生存预后价值。结果:成功建立动态模拟三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞失巢后转移模型。观察到在不同状态下细胞形态有明显改变。Realtime PCR实验结果显悬浮组细胞NSD2 mRNA相较于贴壁组降低,重贴壁组细胞NSD2 mRNA相较于贴壁组、悬浮组升高;Western Blot免疫印迹实验结果显示悬浮组细胞NSD2蛋白表达较贴壁组降低,重贴壁组细胞NSD2蛋白表达相较于贴壁组、悬浮组升高;提示NSD2表达增高可能是细胞失巢凋亡抵抗的重要因素。成功构建稳定表达沉默NSD2的细胞株(shNSD2-1、shNSD2-2)及对照组细胞(shNC)。Calcein-AM/EthD-Ⅰ双染法和Hoechst 33258凋亡实验结果均显示沉默NSD2表达促进细胞失巢凋亡,shNSD2-1、shNSD2-2组细胞凋亡率明显高于shNC组。CCK-8细胞增殖实验结果显示沉默NSD2表达抑制细胞在失巢培养状态下的增殖能力,shNSD2-1、shNSD2-2组细胞增殖速度显著低于shNC组。平板克隆实验结果显示沉默NSD2表达抑制细胞在失巢培养后重贴壁条件下的克隆形成能力,shNSD2-1、shNSD2-2组细胞克隆率显著低于shNC组,克隆体积也显著小于shNC组。Transwell迁移实验结果显示沉默NSD2表达抑制细胞在失巢培养后的迁移能力,shNSD2-1、shNSD2-2组细胞迁移显著降低于shNC组;Transwell侵袭实验结果显示沉默NSD2表达抑制细胞在失巢培养后的侵袭能力,shNSD2-1、shNSD2-2组细胞侵袭率显著低于shNC组。基因芯片显示沉默NSD2表达导致483个基因表达水平发生改变,进行KEGG信号通路富集分析显示差异基因作用于多个肿瘤发生发展相关信号通路,差异基因 FAS、DR5(TNFRSF10B)、MAPK9、DFFA、PARP1、TNFSF10、TRAF1、FOS、BIRC3富集于凋亡相关通路密切相关,其中FAS、DR5为死亡受体信号通路中的关键受体。Western Blot免疫印迹实验结果显示在细胞失巢培养条件下,沉默NSD2表达显著增加死亡受体及下游通路中凋亡相关蛋白表达,shNSD2-1、shNSD2-2 组细胞中 FAS、DR5 及 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Cleaved-Caspase-7、Caspase-8、Cleaved-Caspase-8 表达量均远高于 shNC 组。成功构建TNBC裸鼠尾静脉转移模型,并在裸鼠肺组织中成功检测到人基因组中特异性的Alu序列,并且shNC组Alu序列扩增的Ct值远小于shKD组且p<0.01差异具有统计学意义,提示沉默NSD2抑制TNBC细胞转移。UALCAN数据库分析显示NSD2在乳腺癌组织中的表达高于正常组织,在Luminal型、HER2阳性型、TNBC各亚型中均高于正常组织,且TNBC中NSD2表达显著高于Luminal型、HER2阳性乳腺癌,差异均具有统计学意义;FAS在乳腺癌组织中的表达低于正常组织,在Luminal型、HER2阳性型、TNBC各亚型中均低于正常组织,差异均具有统计学意义;DR5在乳腺癌组织中的表达低于正常组织且差异具有统计学意义,各亚型的表达均低于正常组织,TNBC中位表达值低于正常组织,但差异无统计学意义。在NCBI网站GENE EXPRESSION OMNIBUS模块中检索到所需的TNBC转移相关的基因表达数据集。分析发现发现相较于原位异种移植瘤,NSD2在肺转移灶中的表达明显升高;相较于原发灶组织,FAS、DR5在淋巴结转移组织中的表达明显下降;相较于未发生脑转移患者,FAS、DR5在脑转移患者的TNBC组织中的表达明显下降。在Kaplan-Meier plotter数据库中,发现NSD2高表达时则患者的预后相对较差;在淋巴结阳性组、病理分级Grade 1组、Grade 3组、系统治疗的病人组、化疗、间充质干细胞样组以及仅辅助化疗组中NSD2高表达则患者预后差。发现FAS高表达,TNBC患者预后好;在淋巴结阳性组、病理分级Grade 2组、系统治疗过组、仅辅助化疗组、免疫调节组、间充质组、腔雄激素受体组中以及免疫调节组中FAS高表达,TNBC患者预后好。DR5高表达,TNBC患者预后好;在研究DR5差异表达对不同亚型的TNBC患者RFS影响时发现在病理分级Grade 2组、没未经系统治疗组、免疫调节组、基底样-1型组中DR5高表达,TNBC患者预后好。结论:成功建立动态模拟TNBC细胞失巢后转移模型。TNBC细胞株MDA-MB-231细胞在失巢状态下后细胞形态变圆成团簇状并且NSD2表达降低;重贴壁的细胞获得失巢凋亡抵抗能力,并且NSD2表达增加。失巢状态下,沉默NSD2表达,显著促进MDA-MB-231细胞凋亡,降Broken intramedually nail低细胞活力,显著抑制增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。NSD2通过调控FAS、DR5介导的死亡受体通路以及下游Caspase家族,参与MDA-MB-231细胞失巢凋亡抵抗及肿瘤转移。NSD2、FAS及DR5的表达与TNBC预后密切相关。