在疱疹病毒中,UL15蛋白通常作为末端酶大亚基,在病毒基因组包装过程中起到对串联体基因组剪切和DNA易位的作用。鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)属于疱疹病毒科成员,目前对于UL15蛋白是否为鸭瘟病毒的末端酶大亚基并且是否具有酶活功能尚不清楚。因此本文旨在对DPV UL15蛋白的功能进行探索,初步阐明鸭瘟病毒末端酶大亚基UL15蛋白的酶活功能,为研究DPV基因组的包装过程奠定基础,本文开展的主要研究内容和获得的结果如下:1.DPV UL15_((477-739))截短蛋白的核酸酶活性为探究UL15蛋白是否具有核酸酶功能,本实验首先表达纯化了UL15蛋白C端核酸酶区域UL15_((477-739))用作后续试验。结果显示DPV UL15_((477-739))蛋白具有核酸酶活性,当使用不同质粒作为酶切底物时UL15_((477-AZD6738核磁739))蛋白都能够发挥核酸酶活性对其进行切割,表明核酸酶发挥活性时没有底物特异性。在检测不同金属离子对酶活功能的影响时发现,Mn~(2+)和Mg~(2+)对于核酸酶活性起到催化作用。为探究核酸酶结构域活性位点,对核酸酶结构域各保守位点的突变体进行核酸酶活性检测,结果发现单独突变一个保守位点对核酸酶活性的发挥没有较大的Natural biomaterials影响,但当保守位点全部突变时UL15_((477-739))蛋白核酸酶活性完全丧失。同时DNA结合实验结果显示UL15_((477-739))蛋白无法与DNA进行结合。综上结果表明DPV UL15_((477-739))蛋白在体外仅具有底物非特异性的核酸酶活性,需要二价金属离子催化且没有DNA结合能力,其核酸酶结构域内的D514、E586、D709和D710氨基酸构成其活性中心。2.DPV全长UL15蛋白的核酸酶活性、ATP酶活性及DNA结合能力由于在DPV中基因组的切割需要末端酶复合物识别特异性序列进行切割,但目前的结果显示UL15_((477-739))截短蛋白无法特异性切割DNA,为探究DPV全长UL15蛋白是否具有底物特异性的核酸酶活性、ATP酶活功能及其是否具有DNA结合能力,本研究表达并纯化了重组全长UL15蛋白。核酸酶活性检测结果显示全长UL15蛋白的核酸酶活性不具有底物特异性,但其具有ATP酶活功能,并且ATP酶活性受到二价金属离子的影响。检测ATP酶底物特异性时发现UL15蛋白只能够水解ATP,药物抑制试验结果显示Raltegavir和Tomeglovir能够抑制UL15蛋白的ATP酶活性。此外全长UL15蛋白随着其浓度的增加具有一定的DNA结合的能力。综上结果证明全长UL15蛋白具有核酸酶和ATP酶功能,并且UL15蛋白N端结构域的存在是UL15蛋白发挥DNA结合能力的前提。3.DPV UL15蛋白体外寡聚化的鉴定为探究DPV UL15蛋白在体外是否能够形成寡聚体,本文构建了p CAGGS-UL15-3*flag、p CAGGS-UL15-3*myc、p CAGGS-UL15_((1-476))-3*flag、p CAGGS-UL15_((1-476))-3*myc、p CAGGS-UL15_((477-739))-3*flag、p CMV-myc-UL15_((477-739))真核质粒BMS-354825分子式,使用免疫共沉淀方法检测UL15蛋白分子间是否具有相互作用。同时使用酸性蛋白非变性凝胶电泳检测了UL15_((477-739))蛋白是否能形成寡聚体以及使用蛋白交联试验检测全长UL15蛋白是否能形成寡聚体。结果显示,UL15蛋白分子之间存在相互作用,并且其N端、C端都存在相互作用。Native-PAGE显示UL15_((477-739))蛋白能够形成寡聚化,蛋白交联试验显示全长UL15蛋白能够形成二聚体形态以及更高形态的寡聚体,上述结果说明DPV UL15蛋白能够在体外形成寡聚化。