目的:探索脂氧合酶15B(15-lipoxygenase type B,15-LOX-2)及其代谢产物15(S)-HETE在骨质疏松发生发展的作用和机制,探索预防和治疗骨质疏松的靶标分子。方法:1脂氧合酶15-LOX-2在体内骨质疏松中的作用1.1构建15-Lox-2敲除小鼠和C57小鼠原发中老年骨质疏松模型利用CRISPR/CAS9介导的基因工程技术构建基因敲除小鼠模型。将15-LOX-2~(-/-)小鼠和野生型C57小鼠随机分组,每组5只,6组共30只,给予正常饮食饲养;分时段收集小鼠双后肢及腰椎,送显微计算机X射线断层(Micro CT)扫描骨质疏松相关指标。1.2 Micro CT分析骨质通过三维分析软件(Avatar)进行骨超微结构分析其相关指标:骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数量(Tb.N),结构模型指数(SMI),骨小梁分离度(Tb.Pf),连接密度(Connectivity)等的变化情况。1.3骨染色组织通过石蜡包埋切片,HE染色观察生长板,骨小梁形态。2 15-LOX-2及其代谢产物15(S)-HETE通过焦亡对骨质疏松作用的影响2.1 15-LOX-2敲低骨细胞通过焦亡对骨细胞分化的作用及机制研究分别选择Raw264.7和3T3E1构建15-LOX-2敲低的稳定细胞株,分为三组:NR(对照组),N1252和N2865(n=3);将上述细胞分别诱导破骨和成骨,并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和碱性磷酸酶(ALP)细胞特异性染色鉴定。WB检测细胞内破骨相关蛋白:骨保护素(OPG),骨桥蛋白(SPP1);焦亡相关蛋白:核苷酸结合寡聚结构域(NLRP3),GSDMD等的表达;RT-q PCR检测其焦亡相关基因:GSDMD,白介素1α(IL-1α),NLRP3等的表达。WB检测成骨相关蛋白:胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ),骨钙素(BGLAP/OCN);RT-q PCR检测其骨化相关基因:OPG,G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1);WB检测焦亡相关蛋白:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Ⅰ(Caspase1),白介素1β(IL-1β)的表达;RT-q PCR检测焦亡相关基因重组蛋白(JAK3),Caspase1的表达。2.2 15-LOX-2过表达对通过焦亡对骨细胞分化的作用及机制研究分别用THP-1和3T3E1构建15-LOX-2过表达的稳定细胞株,THP-1分为NR,d3和d4(n=3);3T3E1分为NR,d1和d2(n=3);诱导后通过染色鉴定。RT-q PCR检测破骨细胞中焦亡相关基因,Caspase1,GSDMD,IL-1α等的表达;破骨相关基因C-X-C基序趋化因子配体10(Cxcl10),SPP1,Ⅰ型胶原a1(Co1la1);运用WB检测成骨细胞中焦亡相关蛋白NLRP3,GSDMD等的表达;RT-q PCR检测成骨细胞中焦亡相关基因:JAK3,Caspase1的表达;WB检测成骨细胞相关蛋白CollagenⅠ,OCN的表达;RT-q PCR检测成骨相关基因CollagenⅠ,OCN的表达。2.3 15(S)-HETE对骨细胞的作用及机制与焦亡的相关性2.3.1 15(S)-HETE影响破骨细胞的骨化过程与焦亡的相关性使用Raw264.7和THP-1细胞构建破骨细胞模型,分别给予雌二醇(estradiol,E_2),15(S)-HETE,花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA),E_2+15(S)-HETE和E_2+AA和无水乙醇(溶剂)处理,运用WB及RT-q PCR检测破骨和焦亡相关蛋白和基因的表达。2.3.2 15(S)-HETE影响成骨细胞的骨化过程与焦亡的相关性使用3T3E1和HMSC细胞诱导成骨细胞,实验分组同2.3.1,通过WB和RT-q PCR检测其成骨和焦亡相关蛋白和基因的表达。3.15-LOX-2对骨细胞的作用与Wnt通路的相关性研究3.1 15-LOX-2低表达对骨细胞的作用及机制与Wnt通路的相关性选择Raw264.7,3T3E1敲低的稳定细胞株,进行破骨和成骨诱导。WB检测细胞内Wnt通路相关蛋白表达β-连环蛋白(β-catenin),糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)的表达;RT-q PCR检测Wnt通路相关基因GSK3β,轴抑制蛋白1(Axin-1)等的表达。3.2 15-LOX-2过表达对成骨细胞的作用与Wnt通路相关性研究使用3T3E1过表达的稳定细胞株,成骨诱导后,WB检测细胞内Wnt通路相关蛋白表达Axin1,β-catenin,GSK3β的表达;RT-q PCR检测Wnt通路相关基因GSK3β,Axin-1等的表达。结果:1 15-LOX-2缺失促进小鼠C57骨质疏松的发生发展通过对不同年龄段C57和15-LOX-2~(-/-)小鼠的股骨和腰椎第四节段进行Micro CT分析,透视图可见6月15-LOX-2~(-/-)小鼠骨小梁出现部分稀疏,C57小鼠骨小梁截面基本完整;9月15-LOX-2~(-/-)小鼠透视图可见股骨骨小梁排列更无规则,且已出现大片骨组织空缺;腰椎中心骨小梁区域出现空缺,且棘突处松质骨明显减少。骨密度相关指标显示,6月龄15-LOX-2~(-/-)小鼠连接度(Connectivity)和骨小梁模式因子(Tb.Pf)明显低于C57小鼠(P<0.0001);9月15-LOX-2~(-/-)与C57小鼠相比,C57小鼠结构模型寻找更多指数(SMI)为约为1.57,而15-LOX-2~(-/-)小鼠股骨SMI接近1.95,更趋于杆状骨小梁(P<0.00Ceralasertib研究购买1);15月C57小鼠骨体积和连接密度与9月15-LOX-2~(-/-)小鼠无明显差异(P<0.05)。通过股骨HE染色发现,6月15-LOX-2~(-/-)小鼠与同龄C57小鼠相比生长板处,骨小梁处细胞数量减少,部分位置缺少骨细胞。9月C57小鼠股骨头均出现骨小梁稀疏,骨小梁间隙增大,但15-LOX-2~(-/-)小鼠中松质骨已出现断裂,骨髓组织内细胞出现坏死等表现。2 15-LOX-2及其代谢产物15(S)-HETE对骨细胞分化及其焦亡作用的影响2.1 15-LOX-2敲低骨细胞通过焦亡对骨细胞分化的作用及机制研究2.1.1下调15-LOX-2促进破骨细胞焦亡并加速破骨化进程破骨细胞TRAP染色后可见细胞胞质呈紫红色;WB结果显示:敲低组细胞中GSDMD和NLRP3蛋白水平明显高于对照组细胞;同样,敲低组细胞内GSDMD,IL-1α的m RNA水平显著高于对照组(P<0.05);WB检测破骨相关蛋白显示,SPP1较对照组降低(n=3,P<0.05)。2.1.2下调15-LOX-2促进成骨细胞焦亡而抑制成骨化进程成骨细胞ALP染色可见蓝色沉淀物,通过WB检测成骨细胞中焦亡因子的表达,与对照组相比,敲低组中IL-1β的蛋白水平约是对照组的2倍,总Caspase1蛋白水平也明显增加(n=3,P<0.05);通过WB检测成骨相关蛋白显示过表达组CollagenⅠ较对照组增加(n=3,P<0.05);RT-q PCR检测成骨细胞相关基因显示OCN,CollagenⅠ均升高(P<0.05)。2.2 15-LOX-2过表达骨细胞通过焦亡对骨细胞分化的作用及机制研究2.2.1 15-LOX-2过表达抑制破骨细胞焦亡并减缓破骨化进程THP-1-15-LOX-2过表达细胞诱导破骨细胞后,RT-q PCR检测焦亡相关基因显示,与对照组相比,过表达组Caspase1,GSDMD表达降低(P<0.05);RT-q PCR检测破骨细胞合成相关基因显示,与对照组相比,过表达组中破骨相关基因Cxcl10,SPP1,Co1la1均降低(P<0.05)。2.2.2 15-LOX-2过表达抑制成骨细胞焦亡而促进成骨化进程成功诱导成骨细胞后,WB检测焦亡相关蛋白,过表达组中Caspase1,IL-1β表达增加(n=3,P<0.05);RT-q PCR结果显示,与对照组相比,过表达组中JAK3和Caspase1均升高(P<0.05)。WB检测成骨相关蛋白显示,与对照组相比,过表达组CollagenⅠ和OCN的表达均升高(n=3,P<0.05)。2.3 15(S)-HETE通过焦亡对骨细胞的作用及机制2.3.1 15(S)-HETE调控破骨细胞焦亡减缓破骨细胞的骨化过程成功诱导破骨细胞,分组给药后。WB检测焦亡相关蛋白的表达,AA组NLRP3和IL-1β表达量降低到0.5和0.84,15(S)-HETE较E_2表达降低,E_2+15(S)-HETE组NLRP3和IL-1β均较E_2表达降低(n=3,P<0.05);RT-q PCR检测破骨细胞中15(S)-HETE组JAK3降低20%,E_2+15(S)-HETE组共同降低35%;WB检测破骨相关蛋白,与溶剂组相比,15(S)-HETE组细胞中Cyclin D1表达降低,在E_2+15(S)-HETE组别中,Cyclin D1是对照组的0.73,在AA和E_2+AA组中,Cyclin D1均降低(n=3,P<0.05)。2.3.2 15(S)-HETE调节成骨细胞焦亡增强成骨细胞的骨化过程成功诱导成骨细胞,给予药物后。WB检测成骨化细胞焦亡蛋白的表达,与溶剂组相比较,E_2,AA,15(S)-HETE组NLRP3降低均下降(n=3,P<0.05);WB检测成骨相关蛋白的表达,E_2,AA,15(S)-HETE组EGFR和Cyclin D1表达量均增加(n=3,P<0.05)。3脂氧合酶15-LOX-2通过调控Wnt通路对骨细胞的相关性研究3.1 15-LOX-2敲低抑制Wnt通路,促进破骨,抑制成骨的表达成功诱导破骨,成骨细胞后,WB检测破骨细胞中Wnt通路相关蛋白,对照组相比,GSK3β表达较对照组升高,Cyclin D1是对照组的1.52,1.36(n=3,P<0.05);WB检测成骨细胞中敲低组的GSK3β降低;β-catenin的表达分别是对照组的1.97和0.48;Axin1降低对照组的0.45和0.84(n=3,P<0.05);3.2过表达15-LOX-2激活Wnt通路,促进成骨细胞的分化成功诱导成骨细胞后,通过WB检测Wnt通路相关蛋白显示,成骨细胞中β-catenin,GSK3β,Axin-1表达均升高;RT-q PCR检测成骨细胞中APC,GSK3β,RUNX2均升高(P<0.05)。结论:1脂氧合酶15-LOX-2缺失调控骨细胞焦亡相关蛋白表达、以及Wnt通路蛋白表达,促进破骨化、抑制成骨化进程,从而加速中老年鼠的骨质疏松进程;2 15(S)-HETE具有抗骨质疏松作用,并与雌激素E_2有协同效应,增强E_2抗破骨细胞骨吸收作用;其机制与通过调节焦亡相关蛋白表达,抑制破骨化、促进成骨化进程Microarray Equipment等有关。