白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)简称白介素-1,是重要的免疫和炎症反应调节因子,IL-1β是其JNJ-42756493纯度中行使生物学功能的主要成员,它广泛参与了炎症以及组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程,在病毒、细菌、真菌和寄生虫感染的宿主体内均能发现IL-1β的大量释放。因此,IL-1β成为了治疗炎症性疾病的重要靶标。针对IL-1β的阻断性单克隆抗体因其能与IL-1β高亲和力结合,阻断其与受体作用和下游信号通路的活化而成为炎症性疾病治疗的有效药物。近年来,随着猫、犬等伴侣动物的增多,宠物疾病的防治也越来越受到人们重视,许多猫的炎症性疾病如肾炎、胃肠炎、食管炎等都与IL-1β过量表达有关,但目前还缺少靶向阻断IL-1β的药物。为了填补市场上猫IL-1β的阻断活性单克隆抗体的空缺,本课题拟在表达与纯化具有生物活性的猫IL-1β重组蛋白的基础上,筛选具有阻断活性的猫IL-1β单克隆抗体,并进行猫源化改造,为猫的炎症性疾病治疗提供新的产品。具体内容如下:1.猫IL-1β蛋白的表达纯化及生物活性检测以猫脾脏组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增猫IL-1β基因,将扩增产物克隆至原核表达载体,构建重组质粒p ET30a-IL1β。将重组质粒转入大肠杆菌表达系统,通过Western Blot和间接免疫荧光实验证明目标蛋白能够在菌液上清中表达。接下来将表达IL-1β的大肠杆菌大量培Anti-MUC1 immunotherapy养,利用镍柱亲和层析法进行蛋白的纯化,并通过SDS-PAGE及Western Blot实验证明获得了纯selleckchem NSC125066的猫IL-1β蛋白。将纯化后的IL-1β重组蛋白处理转染了NF-κB荧光素酶报告系统的HEK-293T细胞,证明该蛋白可激活NF-κB的转录因子活性;同时利用荧光定量RT-PCR检测猫IL-1β重组蛋白处理的F81细胞中炎症因子的表达情况,证明该蛋白可诱导细胞中炎症因子的表达,说明本研究表达纯化的猫IL-1β重组蛋白具有生物活性。2.具有阻断活性的猫IL-1β单克隆抗体的筛选将纯化并验证具有生物活性的猫IL-1β蛋白与弗式佐剂完全混合后通过颈背部皮下注射免疫六周龄BALB/C雌性小鼠,三免后对小鼠颌下静脉采血,通过ELISA检测血清中猫IL-1β蛋白的抗体效价,选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫,小鼠冲击免疫7天后取其脾脏制备免疫脾细胞,并与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。重复三次亚克隆后筛选到498株OD值较高的杂交瘤细胞。通过NF-κB荧光素酶报告系统筛选到两株单克隆细胞上清具有猫IL-1β阻断活性,分别命名为H10E和C4C。通过Western Blot以及间接免疫荧光实验证明H10E和C4C以及另外6株OD值较高的单克隆细胞上清均能与猫IL-1β蛋白反应。将这8株单克隆细胞免疫小鼠后,收取腹水并进行抗体纯化。将纯化后的H10E和C4C单抗以不同浓度与IL-1β蛋白共孵育,利用NF-κB荧光素酶报告系统以及荧光定量RT-PCR方法验证其阻断活性,结果证明成功获得了2株具有阻断活性的单克隆抗体。3.猫IL-1β阻断活性单克隆抗体作用位点分析根据生信软件对猫IL-1β功能位点的预测结果,将其分3段进行截短表达,分别命名为N1、N2和N3。以上述扩增的猫IL-1β基因为模板,通过PCR分别扩增3个基因片段,然后将其克隆至原核表达载体p ET-30a中,构建原核表达质粒p ET-30a-IL1β-N1、p ET-30a-IL1β-N2、p ET-30a-IL1β-N3,经过诱导表达和纯化,获得IL1β-N1、N2、N3蛋白。分别将两株具有阻断活性的单克隆抗体与三个重组蛋白反应,通过Western Blot实验证明,单克隆抗体H10E靶向IL-1βN3区域,单克隆抗体C4C靶向IL-1βN2区域。4.猫IL-1β阻断活性单克隆抗体的猫源化改造提取H10E和C4C单克隆细胞总RNA,通过RT-PCR扩增抗体可变区序列VH、VL并测序,将其连接至含有猫抗体恒定区的真核质粒,并将其转染HEK-293T细胞,验证表达成功后收取细胞培养基上清并进行浓缩,将浓缩液与IL-1β蛋白孵育后处理细胞,通过NF-κB荧光素酶报告系统以及炎症因子的表达水平检测证明,猫源化改造后的抗体对IL-1β具有阻断活性。综上所述,本研究成功制备了具有生物活性的猫IL-1β重组蛋白,并筛选到两株具有阻断活性的猫IL-1β单克隆抗体,在对其进行猫源化改造后,具有开发为针对猫IL-1β的阻断活性单克隆抗体药物的潜力。