研究背景:牙周炎是一种慢性炎性疾病,其进展和严重程度受多种系统性疾病以及肠道炎性疾病的影响,如:肥胖、糖尿病、炎症性肠炎。牙周炎和糖尿病之间存在双向关系。糖尿病增加了牙周炎的患病率和严重程度,易表现为严PD-0332991浓度重的牙槽骨吸收、牙齿松动移位、牙周脓肿等临床症状,增加了临床上口腔健康管理的难度。如何有效维护糖尿病牙周炎良好的牙周状况仍是临床和科研上亟待解决的问题。抗生素作为常见的辅助用药,存在耐药性、肠道菌群紊乱购买EPZ-6438、骨质流失等缺点,因此临床上亟需探究新的应用于糖尿病牙周炎的辅助治疗方式。越来越多的证据表明,肠道微生物在伴系统性疾病以及肠道疾病的牙周炎的进展及治疗中发挥重要作用。肠道代谢物通过肠道上皮屏障进入循环中,在宿主表型-微生物组的实际功能方面具有关键作用,是连接肠道和肠外远端器官的桥梁。酪酸梭菌MIYAIRI 588(Clostridium butyricum MIYAIRI 588,CBM588)是一种安全、无毒、无致病性的非处方益生菌,在临床上用于治疗肠道菌群失调和肠道疾病,如儿童性腹泻。CBM588可以调节宿主肠道微生态及代谢,发挥肠外远端器官保护作用。然而,关于CBM588治疗糖尿病牙周炎的牙槽骨破坏方面的应用尚无研究报道。因此,探究CBM588治疗糖尿病牙周炎的作用及机制,具有重要的科研及临床意义。研究目的:构建2型糖尿病牙周炎模型,探究补充CBM588对牙槽骨破坏的作用;然后,基于肠道微生物以及血清代谢的变化,探究CBM588发挥保护作用的机制;在此基础上,验证血清代谢物缓解糖尿病牙周炎牙槽骨吸收的作用及分子机制,以期为糖尿病牙周炎的临床辅助治疗提供新策略。研究方法:1.酪酸梭菌MIYAIRI 588对糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨吸收的作用初探。(1)采用高脂饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射建立2型糖尿病小鼠模型,在此基础上构建牙周炎模型,通过灌胃补充CBM588研究其对糖尿病牙周炎的作用;(2)通过空腹血糖、口服葡萄糖耐量(Oral glucose tolerance test,OGTT)及胰岛素耐量(Insulin tolerance test,ITT)实验分析CBM588对小鼠血糖的影响;(3)通过micro-CT分析、H&E及TRAP染色分析牙槽骨的吸收破坏及破骨细胞表达。2.酪酸梭菌MIYAIRI 588对糖尿病牙周炎小鼠肠道微生态的影响。(1)利用16S r RNA测序检测粪便,研究CBM588对肠道微生物组成的影响;(2)通过结肠组织H&E染色、q RT-PCR、免疫组化染色分析CBM588对肠道炎症和肠道屏障的作用。3.CBM588对糖尿病牙周炎小鼠血清代谢的影响。(1)利用非靶向代谢组学分析CBM588对血清代谢的影响并筛选出关键差异表达代谢物;(2)在非靶向代谢组学的基础上,利用总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)试剂盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒研究CBM588对糖尿病牙周炎小鼠氧化应激的影响。4.血清代谢物4-HBA缓解糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨破坏的作用验证。(1)构建2型糖尿病牙周炎小鼠模型,通过腹腔注射血清关键差异表达代谢物4-羟基苯甲醇(4-Hydroxybenzenemethanol,4-HBA),研究其对糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨丧失的作用;(2)利用T-AObiospray dressingC试剂盒和MDA试剂盒研究4-HBA对糖尿病牙周炎小鼠氧化应激的影响。5.血清代谢物4-HBA抑制糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨破坏的机制初探。(1)运用CCK-8实验检测不同浓度的4-HBA对骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)活性的影响;(2)通过活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测、q RT-PCR、WB等体外实验,结合免疫组化染色实验,研究4-HBA是否通过调控Nrf2信号通路促进抗氧化蛋白的表达缓解氧化应激;(3)通过q RT-PCR、WB等检测技术,同时运用免疫组化以及免疫荧光染色实验,检测4-HBA是否通过调控BMDMs分化以及相关炎性分子的表达发挥抗炎作用。研究结果:1.通过高脂喂养联合注射STZ成功构建了2型糖尿病小鼠模型,表现为空腹血糖≥11.1mmol/L。CBM588处理2周后,糖尿病牙周炎小鼠空腹血糖降低。OGTT及ITT实验表明CBM588可以改善糖尿病牙周炎小鼠的糖代谢能力以及胰岛素抵抗。Micro-CT及H&E染色结果进一步表明糖尿病牙周炎组的牙槽骨吸收高于牙周炎组,且CBM588缓解糖尿病牙周炎小鼠的牙槽骨吸收。TRAP染色结果显示与牙周炎组对比,糖尿病牙周炎组的破骨细胞增加,补充CBM588可减少破骨细胞表达。2.粪便16S r RNA测序结果表明糖尿病加重牙周炎的肠道菌群紊乱,CBM588处理恢复糖尿病牙周炎小鼠的肠道微生物稳态。q RTPCR及结肠组织染色结果显示糖尿病加重牙周炎下的肠道炎症且降低其肠道紧密连接蛋白表达,而CBM588处理后使糖尿病牙周炎小鼠肠道的炎症缓解以及紧密连接蛋白表达提高。3.非靶向代谢组学检测结果发现CBM588改变糖尿病牙周炎小鼠的血清代谢,显著增加血清中4-HBA的浓度而降低血清中氧化型谷胱甘肽的含量。基于非靶向代谢组学的结果,进一步发现CBM588处理后,糖尿病牙周炎小鼠的T-AOC升高以及MDA含量降低。4.Micro-CT及H&E染色结果表明4-HBA处理后糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨吸收降低。TRAP染色结果显示4-HBA减少糖尿病牙周炎小鼠牙槽骨中的破骨细胞。此外,4-HBA处理使糖尿病牙周炎小鼠的TAOC升高以及MDA降低。5.4-HBA(0-1000μM)对BMDMs活性无影响。高糖炎性条件下促进BMDMs产生ROS,而4-HBA处理BMDMs后抑制ROS的产生。q RT-PCR以及WB结果显示4-HBA促进BMDMs的Nrf2以及其下游的抗氧化蛋白HO-1、NQO-1的表达。此外,高糖炎性条件下促进BMDMs向M1型巨噬细胞分化以及炎症因子的表达,而4-HBA可以逆转这种变化。此外,高糖炎性条件下,4-HBA促进BMDMs向M2型巨噬细胞分化。结论:CBM588通过调节肠道微生态提高血清代谢物4-HBA,发挥对糖尿病牙周炎小鼠的牙槽骨保护作用;该作用与4-HBA激活Nrf2信号通路清除氧化应激损伤、调控巨噬细胞极化以及抗炎作用相关。本研究确定了CBM588调节肠道微生物和4-HBA作为有益代谢物改善糖尿病牙周炎的新作用,为探寻糖尿病牙周炎的辅助治疗方式及其作用机制提供新的见解和策略。