目的:1.设计合成6-羟基染料木素(6-hydroxygenistein,6-OHG)及其四个甲基化衍生物,并对其抗缺氧活性和构效关系进行考察。2.阐明6-OHG对缺氧PC12细胞损伤的保护作用机制。方法:1.以鹰嘴豆芽素A为原料,经过甲基化、溴化、甲氧基化及去甲基化的方法合成了6-OHG及其四个甲氧基化衍生物。通过光学显微镜观察其对缺氧PC12细胞的形态的影响,DPPH自由基清除实验检测其清除自由基能力,CCK-8法测定细胞活力考察其抗缺氧活性,并根据结果总结构效关系。2.将PC12细胞分为正常对照组、缺氧模型组、芦丁组及6-OHG组此网站。光学显微镜观察细胞形态;CCK-8法测定细胞活力;酶标仪检测LDH、ROS、MDA、GSH、SOD、CAT、ATP、Na~+-K~+-ATPase、TNF-α、IL-6、IL-10、Caspase-3、Caspase-9等指标水平;免疫荧光染色检测Nrf-2、HO-1表达变化;JC-1荧光探针测定线粒体膜电位变化;TUNEL染色以及流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western Blot检测HIF-1α、VEGF、Nrf-2、HO-1、NF-κB、TNF-α、Bcl-2、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白的表达。3.将PC12细胞分为正常对照组、缺氧模型组、6-OHG组以及6-OHG+ML385组。光学显微镜观察细胞形态;CCK-8法测定细胞活力;测定LDH、ROS、MDA、GSH及SOD等指标水平;免疫荧光染色检测Nrf-2、HO-1表达变化;TUNEL染色以及流式细胞术检测各组PC12细胞的凋亡情况;Western Blot检测Nrf-2、HO-1、NF-κBHepatic encephalopathy、TNF-α、Bcl-2、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果:1.以该合成路线制备6-OHG,最终产率为49.37%。6-OHG与化合物7组能够有效清除DPPH自由基、改善缺氧PC12细胞形态,显著增加细胞活力。通过构效关系分析发现,6-OH引入形成的邻三酚羟基基团可能是6-OHG发挥抗缺氧活性的主要基团。2.与正常对IACS-010759配制照组相比,缺氧模型组细胞胞体暗淡且细胞核脱落,培养液中LDH含量显著增加,细胞活力显著下降;细胞内ROS与MDA含量显著升高,抗氧化酶CAT、SOD及GSH水平显著降低,HIF-1α和VEGF的蛋白表达显著上调,细胞炎性因子中IL-10水平显著降低,TNF-α和IL-6水平显著升高,NF-κB和TNF-α蛋白表达显著上调;ATP的含量及Na~+-K~+-ATPase的活性显著降低;Caspase-3和Caspase-9活性显著升高,Bax/Bcl-2的比值以及Cleaved Caspase-3蛋白的表达显著增加。与缺氧模型组相比,6-OHG给药后细胞形态良好、细胞膜较完整,且能够显著提高细胞活力,降低细胞中ROS与MDA含量,提高抗氧化酶CAT、SOD及非酶抗氧化剂GSH的水平,HIF-1α、VEGF信号通路被抑制;细胞中抗炎因子IL-10水平显著升高,促炎因子TNF-α和IL-6水平显著降低;细胞中ATP的含量显著增加,Na~+-K~+-ATPase活性显著升高;细胞凋亡率显著下降,Caspase-3和Caspase-9的活力显著下降,Bax/Bcl-2的比值以及Cleaved Caspase-3蛋白的表达显著下调。3.与6-OHG组相比,6-OHG组+ML385组细胞胞体暗淡且细胞核脱落,细胞活力显著下降;ROS与MDA水平显著升高,CAT、SOD及GSH水平显著降低;NF-κB和TNF-α的蛋白表达显著升高;细胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值以及Cleaved Caspase-3蛋白的表达显著升高。结论:1.邻三酚羟基是6-OHG发挥抗氧化和抗缺氧作用的主要基团,6-OHG较其他四个甲基化衍生物具有更好的抗缺氧和抗氧化活性。2.6-OHG能够有效改善缺氧PC12细胞形态,提高细胞活力,缓解氧化应激和能量代谢障碍,降低炎症反应以及细胞凋亡,有效缓解缺氧诱导的PC12细胞损伤。3.Nrf-2抑制剂能够逆转6-OHG对缺氧PC12细胞的保护作用,提示6-OHG是通过激活Nrf-2/HO-1信号通路缓解缺氧诱导的损伤。