第一部分 溃疡性结肠炎中血脂与5-ASA疗效的相关性分析目的:探究血脂水平与溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)疾病活动和预后的关系以及对5-氨基水杨酸(5-Aminosalicylic acid,5-ASA)疗效的影响。方法:连续收集了 2003年1月至2020年9月具有详细血脂报告的497名UC患者的回顾性数据,分为短期血脂队列和长期血脂队列,进行单因素、多因素以及生存分析评估血脂水平与疾病活动度、远期结局以及5-ASA疗效的相关性,同时根据血脂谱行亚组分层分析评估各类血脂与疾病活动度与预后的相关性。所有患者均随访至2021年9月30日。结果:1.与血脂正常的UC患者相比,血脂异常患者表现出更严重的疾病活动。高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C,p<0.05)水平与疾病活动度负相关(p<0.05)。2.与短暂性血脂异常和血脂正常的患者相比,持续性血脂异常患者的UC相关手术风险(风险比[Hazard ratio,HR]:3.27,95%置信区间[Confidence interval,CI]:1.86-5.75,p<0.001)和肿瘤发生风险(HR:7.92,95%CI:3.97-15.78,p<0.001)更高、无手术和无肿瘤生存期更短(均p<0.001)。HDL-C(均p<0.001)和载脂蛋白 A1(Apolipoprotein A1,ApoA1,均p<0.05)水平与手术、肿瘤发生风险负相关。3.接受5-ASA治疗的UC长期血脂队列中,与高HDL-C组相比,低HDL-C组的药物升级率更高(100.0%vs.74.4%,p<0.001),而粘膜愈合率更低(23.2%vs.41.8%,P=0.014)。低HDL-C水平是5-ASA治疗的UC患者药物升级(HR:1.63,95%CI:1.24-2.18,p<0.01selleck激酶抑制剂)和粘膜愈合(HR:0.56,95%CI:0.33-0.96,p<0.05)的独立影响因素,低HDL-C组的患者更早升阶梯治疗(HR:1.72,95%CI:1.31-2.25,p<0.001)和更晚实现粘膜愈合(HR:0.57,95%CI:0.34-0.97,p<0.05)。结论:1.UC患者的持续性血脂异常(特别是低HDL-C水平),与严重疾病活动风险和不良预后相关。应评估血脂模式,以改善UC早期高危患者的管理。2.相比高HDL-C水平,低HDL-C水平的UC患者5-ASA治疗药物疗效更差。血脂代谢尤其是HDL-C水平应纳入5-ASA用药策略的考虑变量中,同时为药物升阶梯治疗提供时机的参考。第二部分5-ASA与高脂饮食对小鼠急性结PacBio and ONT肠炎的影响及免疫机制背景和目的:溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)患者血脂水平与疾病活动度及预后相关,且5-ASA(5-Aminosalicylic acid,5-ASA)在血脂异常患者中抗炎效果欠佳。本研究旨在探究5-ASA与高脂饮食(High fat diet,HFD)对急性结肠炎的保护作用及其免疫机制。方法:1.建立C57BL/6葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)小鼠结肠炎模型,分为等热量对照饮食(Control diet,CD)非模型对照(CD-NC)组、CD-DSS模型组、CD-5ASA治疗组、HFD-NC组、HFD-DSS模型组、HFD-5ASA治疗组。通过体重下降、疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、结肠镜下结肠炎评分、结肠长度和结肠组织病理评分评估结肠炎严重程度。同时收集血清标本检测血脂水平,收集结肠标本采用荧光实时定量聚合酶链式反应(Quantitive Real-time Polymerase chain reation,qRT-PCR)法检测细胞因子信使 RNA(Messenger RNA,mRNA)表达水平。2.分离和提取小鼠肠道固有层免疫细胞,采用流式细胞术检测肠道免疫细胞比例和分型;收集小鼠结肠组织蜡块,采用多重免疫荧光评估肠道巨噬细胞浸润情况。3.从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)获取活动期UC患者和正常人粘膜表达谱数据,使用CIBERSORT算法进行免疫浸润分析。收集UC患者结肠组织标本,分为血脂正常组(n=3)、高TC组(n=3)和低HDL-C组(n=3),采用免疫组化染色分别检测各组5-ASA治疗前后的肠道巨噬细胞。4.体外构建THP-1炎性巨噬细胞模型,分别予5-ASA和脂质混合物(Lipid mixture,LM)干预后行细胞转录组测序,筛选出各干预组差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),行基因本体论(Gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。5.利用THP-1和小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PM)体外构建炎性巨噬细胞模型,予5-ASA、LM和HDL-C单药和联合用药干预后采用CCK8法测定药物毒性,并行qPCR检测炎症因子表达水平。结果:1.在小鼠实验中,与CD-DSS组相比,CD-5ASA组小鼠第10天DAI、结肠缩短程度、内镜下结肠炎评分、组织病理评分有减低趋势,但未见统计学差异(均p>0.05);HFD-5ASA 组相比 HFD-DSS 组,逆转了血清 HDL-C 的下降(p<0.05),同时小鼠第10天DAI、结肠长度短缩程度、内镜下结肠炎评分和组织病理评分均显著减低(均p<0.05)。和对应饮食的模型组相比,HFD-5ASA组中结肠黏膜炎症因子包括白介素-1β(Interleukin-1 Beta,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子 α(Tumor necrosis factor alpha,TNF α)的 mRNA 相对表达量下降(均p<0.05),白介素-10(Interleukin-10,IL-10)的mRNA相对表达量升高(p<0.001),而CD-5ASA组中未见上述变化。流式细胞检测和多重免疫荧光结果表明,相比HFD-DSS组,HFD-5ASA组小鼠肠道单核细胞和巨噬细胞比例显著下降(n=6,均p<0.05),且M1巨噬细胞比例降低、M2巨噬细胞比例升高(均p<0.05)。2.GEO数据库免疫浸润分析中,与健康人相比,活动期UC患者肠道M0和M1巨噬细胞比例升高(均p<0.05)、M2巨噬细胞比例降低(p<0.0.001)。人体结肠组织标本的CD68免疫组化结果显示,血脂正常组的UC患者的结肠病变部位在5-ASA治疗后比治疗前的巨噬细胞浸润减少(n=3,p<0.05),而在高总胆固醇(Total cholesterol,TC)和低HDL-C水平组中治疗前后未见显著变化(各n=3,均p>0.05)。3.体外炎性巨噬细胞模型RNA测序结果中,GO富集分析显示5-ASA处理与炎症反应和巨噬细胞分化明显相关,混合脂质(LM)干预与巨噬细胞中炎症反应和药物反应通路等显著相关。KEGG通路富集分析显示5-ASA处理后DEGs在炎症性肠病相关通路、多种细胞因子信号及多种免疫细胞相关通路富集,LM处理后DEGs主要在炎症因子信号通路以及IBD相关通路等富集。Control组相比Blank组上调了多种炎症因子、炎症因子受体以及趋化因子相关基因表达,5-ASA和LM处理均可使Control组中变化的基因表达水平正常化。(均p<0.05)4.THP-1和PM体外炎性巨噬细胞模型中共同验证了,单药5-ASA明显上调抑炎因子表达,单药LM或者HDL-C明显下调促炎因子的表达,5-ASA联合LM或HDL-C可下调多种促炎因子,同时上调多种抑炎因子。结论:1.5-ASA联合HFD可上调HDL-C水平,同时抑制肠道巨噬细胞的浸润、降低M1型巨噬细胞比例、升高M2型巨噬细胞比例,下调结肠组织黏膜的促炎因子表达、上调抑炎因子表达,明显减轻DSS小鼠结肠炎炎症。2.5-ASA联合脂质通过下调炎性巨噬细胞促炎因子水平、上调抑炎因子水平,发挥直接抗炎作用。第三部分 5-ASA与高脂饮食对小鼠急性结肠炎中肠道菌群的影响背景和目的:饮食和肠道菌群是溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)发病机制的核心因素,5-ASA联合高脂饮食(MCC950化学结构High fat diet,HFD)显著缓解小鼠结肠炎症。本研究旨在探究5-ASA与HFD对急性结肠炎的抑炎作用与肠道微生态的关系。方法:构建C57BL/6高脂饮食的葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)小鼠结肠炎模型后分成六个实验组:等热量对照饮食(Control diet,CD)非模型对照(CD-NC)组、CD-DSS模型组、CD-5ASA治疗组、HFD非模型对照(HFD-NC)组、HFD-DSS模型组和HFD-5ASA治疗组。收集小鼠新鲜粪便标本,根据标本收集时间分为三组:①基线组包括CDO(CD预处理前)和HFDO(HFD预处理前);②饮食预处理后组包括CD1(CD预处理后)和HFD1(HFD预处理后);③治疗后组包括CD-NC、CD-DSS、CD-5ASA、HFD-NC、HFD-DSS、HFD-5ASA。基于 V3-V4 可变区,使用16S rDNA扩增子测序技术,对各组小鼠粪便进行α多样性和β多样性分析以比较各组肠道菌群多样性和结构差异,同时比较各组间菌群在门、科和属水平上丰度差异。应用LEfSe分析识别各组中的特征细菌分类群,同时采用Spearman相关性分析方法分析临床指标、炎症因子、血脂水平与属水平粪便细菌丰度之间的相关性。结果:1.饮食预处理前后的四个实验组(CD0、HFD0、CD1和HFD1)共68个样本中有962个共有扩增子序列变异(Amplicon Sequence Variants,ASVs),四组间α多样性未见显著性差异(p>0.05),但β多样性分析显示HFD处理后微生物结构与CD处理组相比存在明显差异(p<0.001)。对门、科、属和种水平上丰度变化最大的细菌进行T检验分析,结果显示HFD处理使正常小鼠的肠道菌群在各水平上发生结构性改变(均p<0.05)。2.在 DSS 和药物干预的六个实验组(CD-NC、CD-DSS、CD-5ASA、HFD-NC、HFD-DSS和HFD-5ASA组)共36个样本中共有ASVs有209个,相比CD-NC组,HFD-NC组肠道菌群的丰度未见显著差异(Tukey检验,p>0.05),但生物多样性增加(Wilcox检验,p<0.05)。DSS处理显著降低了粪便菌群丰度和多样性,5-ASA只在HFD-DSS小鼠中逆转了这种变化(均p<0.05)。DSS处理在门、科和属水平上下调多种有益菌和中间菌的丰度、上调有害菌的比例,但5-ASA只有在HFD-DSS组中逆转这种改变(均p<0.05)。线性判别分析效应大小(LDA Effect Size,LEfSe)分析显示 CD-NC、CD-DSS、CD-5ASA、HFD-NC、HFD-DSS 和 HFD-5ASA 六个实验组中特定分类群的数目分别有5、5、3、11、1和6个,Spearman相关性分析确定了属水平上的毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)丰度与临床指标包括DAI评分、内镜下评分、组织病理学评分以及肠道巨噬细胞浸润呈负相关,而与结肠长度呈正相关。同时,毛螺菌科NK4A136群丰度与所有促炎因子表达水平负相关、和抑炎因子IL-10表达水平正相关(均p<0.01)。另外,毛螺菌科NK4A136群丰度与血清HDL-C水平正相关(p<0.01)。结论:HFD处理对正常小鼠肠道菌群具有调节作用,5-ASA联合HFD可改善肠道菌群失调,毛螺菌科_NK4A136群是5-ASA联合HFD发挥抗炎作用的潜在有益菌属,其丰度与血清HDL-C水平正相关。