猪源肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,Ex PEC)是一类能够引起肠道以外多种器官组织病变的病原菌,常与其他病原菌混合感染猪群,引起猪的脑膜炎、肺炎、关节炎和败血症。在我国,猪源Ex PEC有分离率高、耐药性广、人畜共患潜力大等特点。这些导致抗生素治疗难,病猪死亡率高等问题,给养殖业造成巨大经济损失的同时危害人类公共安全。本试验先初步检测了黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033生长性能的影响及其在猪源Ex PEC PCN033体外感染宿主细胞过程中的作用。之后建立小鼠感染模型,通过比较小鼠存活率、体重变化、临床病变、组织载菌量及组织病理变化等指标,进一步探究了黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033感染小鼠的保护作用。最后深入挖掘猪源Ex PEC PCN033感染宿主NF-κB、MAPK信号通路和NLRP3炎性小体的激活作用以及黄芩苷的调控机制。1、黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌感染细胞的保护作用。本试验首先通过黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的最小抑菌浓度和生长特性测定,初步判断黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的生长是否具有抑制作用并确定黄芩苷的最适作用浓度;其次通过测定猪源Ex PEC PCN033黏附、入侵猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)及猪肾上皮细胞(PK-15)和在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)内增殖的能力进一步确定黄芩苷是否对猪源Ex PEC PCN033侵袭宿主细胞具有保护作用;最后通过乳酸脱氢酶试验(LDH)测定黄芩苷是否对猪源Ex PEC PCN033介导的细胞损伤具有保护作用。结果显示,黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的最小抑菌浓度大于1600μg/m L。此外25、50、100μg/m L的黄芩苷对猪源Ex PEC PCN033的生长特性没有影响,并且对细菌在3D4/21细胞内的增殖没有作用。但是黄芩苷能够抑制猪源Ex PEC PNaporafenib研究购买CN033对IPEC-J2和PK-15细胞的黏附和入侵,并对其造成的三种细胞损伤有保护作用。2、黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌感染小鼠的保护作用。试验选取四周龄雌性昆明小鼠,随机分组。治疗组和感染组小鼠通过腹腔注射的方式建立猪源Ex PEC PCN033感染,每只小鼠感染1×10~7 CFU PCN033。治疗组小鼠皮下多点注射50寻找更多 mg/kg黄芩苷,首次给药在攻毒后,每日给药2次,直至小鼠剖检当日。攻毒后观察并记录小鼠临床状态、体重变化及死亡情况。在攻毒后6 h,麻醉小鼠并取心、肝、脾、肺、肾、脑、血液,充分研磨并稀释,用于记录各组织载菌量。同时取各组织浸泡于4%多聚甲醛固定,用于病理切片观察。结果表明,感染后小鼠状态萎靡,采食量下降,体重降低,感染组和治疗组均出现小鼠的死亡,且感染组小鼠死亡率及死亡速度均高于治疗组。剖检后,空白对照组无明显病变,各处理组脏器均出现不同程度的病变,但是治疗组的病变程度较感染组缓解。组织病理结果显示,治疗组病理变化程度较感染组轻。组织载菌量结果显示,治疗组的血液及各组织载菌量较感染组均显著降低。3、黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌激活宿主炎性信号通路的影响。首先通过细胞毒性试验初步探究黄芩苷对3D4/21的细胞毒性,以选择后续细胞试验最适药物浓度。其次通过Q-RT PCR的方法测定共培养3 h炎性基因IL-1β、IL-6、IL-8及核转录因子AP-1(c-jun和c-fos)的基因表达量;采用ELISA的方法测定共培养3 h炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8的释放量;采用Western blot方法测定细胞和小鼠NF-κB信号通路蛋白(P65、p-P65、IκBα、p-IκBα)及NLRP3炎性小体蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1)的表达量,测定细胞MAPK信号通路蛋白(JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、P38、p-P38)表达量。细胞试验分组分别为空白对照组、PCN033造模组、PCN033+黄芩苷处理组(25、50、100μg/m L),小鼠试验分组分别为空白对照组、PCN033造模组和50 mg/kg黄芩苷治疗组。细胞处理方法为先加入黄芩苷预处理1 h,再加入MOI为10:1的菌量共培养;小鼠感染方法同试验二,感染量为5×10~6CFU。细胞毒性试验结果显示25、50、100和200μg/m L的黄芩苷处理后对细胞没有明显毒性。因此,选用25、50、100μg/m L黄芩苷进行后续细胞试验。Q-RT PCR结果显示,猪源Ex PEC PCN033感染3D4/21后,IL-1β、IL-6、IL-8的转录水平显著上调,黄芩苷可显著抑制这些炎性因子的转录水平;猪源Ex PEC PCN033感染3D4/21后,核转录因子c-jun、c-fos的转录水平显著上调,黄芩苷可显著抑制核转录因子的转录水平。ELISA结果显示,猪源Ex PEC PCN033感染3D4/21后,IL-1β、IL-6、IL-8的释放水平显著上调,黄芩苷作用后可显著抑制这些炎性因子的释放水平。Western blot结果显示,猪源Ex PEC PCN033感染宿主细胞后,p-P65、p-IκBα、p-JNK、p-ERK、p-P38及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平均显著上调,黄芩苷处理组以上蛋白的表达水平均显著下调;猪源Ex PEC PCN033感染小鼠后,p-P65、p-IκBα、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平均显著上调,50 mg/kg黄芩苷治疗组以上蛋白的表达水平均显著下调。综上所述,systemic immune-inflammation index黄芩苷在不影响猪源Ex PEC PCN033的生长及在细胞内增殖的前提下,通过下调宿主NF-κB、MAPK信号通路的表达,抑制NLRP3炎性小体的激活,降低猪源Ex PEC PCN033感染造成的细胞损伤及对小鼠的致病性,发挥体内外的保护作用。本试验结果为黄芩苷用于治疗猪源Ex PEC感染提供了科学依据。