植物病毒病是危害植物生长最严重的病害之一,降低作物产量、影响品质,对我国农业经济造成巨大损失。弱毒疫苗交叉保护是预防植物病毒病的一种有效措施,但疫苗存在剂型单一、货架期短、单剂疫苗所能防治的靶标病毒有限等限制。鉴于病毒病的混合侵染特性,有必要研制能够兼抗多种植物病毒病的单剂多联弱毒疫苗,并优化疫苗的保存方式,延长其货架期。黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)是宿主数量最多、分布范围最广的植物病毒之一,并且其多节段基因组为致弱突变提供多个位置选择,在弱毒疫苗的研制中具有极大潜力。本研Negative effect on immune response究以黄瓜花叶病毒为基础疫苗载体骨架,构建单联双靶、双联三靶、三联四靶弱毒疫苗,同时比较不同低温保存法的疫苗保质期,为植物病毒病的防治提供弱毒疫苗材料和延长货架期的可行性方案。以构建的CMV_(Fny)RNA2弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII、p CC_FR2-2b PTIII为疫苗基础载体。在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII中插入TVBMV不同保守区域的100 bp病毒片段(TVBMV_(7600-7699)、TVBMV_(7700-7799)、TVBMV_(8880-8979)、TVBMV_(8980-9079)),构建了4种单联双靶弱毒突变体;在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTII中插入来源于TVBMV和TMV的共221bp不同组合片段(TVBMV_(7600-7699)TMV_(2158-2278)、TMV_(2158-2278)TVBMV_(7600-7699)),构建了2种双联三靶弱毒突变体;在弱毒突变体p CC_FR2-2b PTIII中插入来源于TVBMV、TMV和PVY不同排列顺序的共321 bp片段(TMV_(2158-2278)PVY_(517-616)TVBMV_(7600-7699)、TMVGSK2118436试剂2158-2278TVBMV7600-7699PVY517-616、PVY517-616TVBMV7600-7699TMV2158-2278、PVY517-616TMV2158-2278TVBMV7600-7699、TVBMV7600-7699PVY517-616TMV2158-2278、TVBMV_(7600-7699)TMV_(2158-2278)PVY_(517-616)),构建了6种三联四靶弱毒突变体。将各突变体分别与CMV_(Fny)野生型RNA1和RNA3混合后接种本氏烟,均显示弱致病性且具备良好的遗传稳定性。预先接种以上突变体7 d后进行靶标病毒的单独或混合挑战接种,对CMV的防效最好(72.0%～100%),对各靶标病毒也显示一定的防效(7.4%～46.2%)。在单联双靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,TVBMV的4种插入型突变体对TVBMV的交叉保护效果差异较明显,插入TVBMV_(7600-7699)片段的突变体对TVBMV和混合强毒的防效最好,分别为37.0%和22.2%;在双联三靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,各突变体对TVBMV、TMV以及混合强毒均表现良好的交叉保护效果,分别为40.0%～44.4%、32.0%～37.0%、24.0%～32.0%,对靶标病毒的防效与病毒片段插入顺序不显示明显相关性;在三联四靶弱毒突变体的交叉保护效果实验中,6种突变体对CMV、TVBMV、TMV和PVY单独或混合侵染均表现良好的交叉保护效果,对各靶标病毒单独侵染的防效分别为87.0%～100%、22.2%～46.2%、22.2%～44.4%和28.5%～44.4%,对混合强毒的防效为16.0%～37.0%,对靶标病毒的防效与病毒片段插入顺序不显示明显相关性。为指导田间应用和尽可能地降低疫苗使用成本,需要确定疫苗稳定存在的接种起始浓度范围。对突变体p CC_FR2-2b PTII以及插入100 bp、221 bp异源病毒片段的突变体(起始菌液OD_(600)=1.2)的稀释限点进行分析。突变体p CC_FR2-2b PTII稀释10~1～10~5倍后接种,仍然具备良好的遗传稳定性,病情指数为3.7～26.0,维持弱毒特征;插入100 bp异源病毒片段的突变体在稀释10~4倍后开始出现一定比例的突变回复现象,在稀释10~5倍后基本已完全回复,病情指数达到48.1,显示一定的强毒特征;插入221 bp异源病毒片段的突变体在稀释10~3倍后开始出现突变回复现象,并随着稀释倍数增大,回复越完全,稀释10~5倍后接种的病情指数达到70.4,已回复为强毒。综上表明,疫苗使用过程中,过度稀释的起始接种浓度会导致疫苗稳定性下降。初始浓度OD_(600)=1.2的疫苗菌液在田间使用过程中建议稀释倍数不要超过10~2倍。为降低大体积菌液型疫苗的保存和长途运输成本,本研究比较分析了菌液型弱毒疫苗的3种低温保存方法(离心保存法、直接冻干保存法、离心冻干保存法)处理后的疫苗稳定性和交叉保护效果。离心保存法:高速离心去上清的疫苗菌体在两组低温下(4℃,-20℃)保存15 d,30 d或60 d后重悬接种,均表现良好的遗传稳定性,对CMV的交叉保护效果良好,随着保存时间的延长,相对防效逐渐降低,在4℃保存15 d,30 d和60 d后接种的相对防效为74.1%、51.9%和51.9%,在-20℃保存15 d,30 d和60 d后接种的相对防效为74.1%、59.3%和44.4%,而在28℃条件下保存15 d、30 d,疫苗仍具备良好稳定性,对CMV的交叉保护效果相比于两组低温保存来说更差,仅为37.0%、22.2%,而保存60 d后已完全回复至野生型,基本不再表现明显的交叉保护效果,相对防效只有7.4%。直接冻干保存法:菌液型疫苗经冻干机处理后的疫苗菌粉在4℃,-20℃保存30 d、60 d后重悬接种,均具备良好的遗传稳定性,且对CMV表现非常好的交叉保护效果,相对防效均在88.0%以上。离心冻干保存法:高速离心去上清的菌体经冻干机处理的疫苗菌粉在4℃,-20℃保存30 d、60 d后分别用灭菌水、纯水、自来水重悬接种,均具备良好的遗传稳定性,保存30 d的各处理组对CMV的相对防效达到72.0%以上,而保存60 d后用灭菌水重悬要优于用纯水、自来水重悬,在4℃保存重悬的整体相对防效(66.7%～100%)要高于在-20℃保存重悬的相对防效(66.7%～74.1%)。以上三种菌液型疫苗的低温冻存法,解决了菌液型疫苗不易大体积保存的难题,提高了长距离运输的便利性,同时也降低了成本。本研究筛选出了遗传稳定、兼抗多种病毒的12种多联弱毒疫苗,为相应种类的植物病毒病防治提供了疫苗材料;同时疫苗稀selleck HPLC释后稳定性分析以及3种低温保存法的比较,为疫苗应用过程中降低使用、保存、运输成本提供了数据支持。