粮食、饲料等农产品在运输、储存和加工过程中极易因污染黄曲霉和寄生曲霉造成黄曲霉毒素残留,严重危害人体健康。黄曲霉毒素及其衍生物共约20余种,其中黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)最为常见。AFB_1随饲料进入动物体内,经过羟基化反应转化成黄曲霉毒素M_1(Aflatoxin M_1,AFM_1)后,随乳汁排出。随着我国人民生活水平的提高,人们对具有丰富营养的乳及乳制品的摄入量逐渐增加。而AFM_1化学结构稳定、耐高温,在食品加工过程中难以分解,因此乳及乳制品中AFM_1的监测对维护消费者,尤其是婴幼儿的身体健康具有重要意义。目前AFM_1的检测方法主要是依赖大型设备的仪器分析法。这类检测方法虽然灵敏度高,但其因所需设备昂贵非便携、样本前处理过程复杂以及对操作人员要求高等弊端无法实现现场大规模筛查。而侧流免疫层析技术(Lateral Flow Immunochromatography Assay,LFIA)则因操作简便且可裸眼判读结果,十分适于现场快速检测。免疫层析试纸条性能与抗体性能和探针材料密切相关。其中,使用具有高免疫亲和力的、特异性强的抗体可有效提高免疫分析的灵敏度和特异性;而采用具有强信号输出能力的新型探针材料替代光学信号偏弱的传统胶体金探针,亦可有效提高LFIA灵敏度,满足日趋严格的食品安全检测要求。聚集诱导发光(Aggregation-induced Emission,AIE)是指一类在稀溶液中不发光或微弱发光的分子,在聚集状态或固体状态时强发光的现象。AIE荧光分子具有斯托克斯位移大、抗光漂白性强、稳定性高等优点,将AIE分子制备成AIE荧光微球(Aggregation-induced Emission Fluorescent Microspheres,AIEFMs)应用于免疫层析试纸条中可显著提高试纸条的灵敏度。因此,本研究以抗AFM_1单克隆抗体的制备及其AIEFMs-LFIA的研发为主进行了以下工作:(1)抗AFM_1单克隆抗体的制备。通过CMO修饰AFM_1分子,KPT-330合成含有羧基连接臂的AFM_1半抗原;再通过EDC/NHS方法将其与载体蛋白KLH/OVA偶联,合成既具备免疫原性又具备反应原性的完全抗原。使用该全抗原免疫小鼠,经细胞融合、杂交瘤细胞筛选及克隆等步骤筛选得到一株产AFM_1单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G12。通过ELISA对5G12所产抗体的性能进行评价,结果表明:该抗体的亲和力Ka可达到5.39×10~8L/mol;以AFM_1-OVA作为检测抗原时,ELISA检测AFM_1的IC_(50)为0.458 ng/m L,LOD为0.135 ng/m L;该抗体与AFB_1、AFB_2及AFG_1等常见黄曲霉毒infections respiratoires basses素均具有较大的交叉反应率,是一株广谱性抗体。基于该抗体与常见黄曲霉毒素交叉反应率高这一特性,本研究进一步评价了以AFB_1-BSA替代价格昂贵的AFM_1-OVA作为检测抗原时的检测性能。结果表明,以AFB_1-BSA为检测抗原时检测AFM_1的IC_(50)为0.475 ng/m L,LOD为0.120 ng/m L,与以AFM_1-OVA为检测抗原时所得结果相似。因此,基于5G12抗体的免疫分析法可使用价INCB018424供应商格更低的AFB_1-BSA作为替代检测抗原,降低检测成本,利于检测产品的大量生产和市场应用。同时,因牛乳中不含AFB_1,以AFB_1-BSA为检测抗原不会造成AFM_1检测的非特异性。(2)用于检测AFM_1的AIEFMs-LFIA的研发。将上述抗AFM_1抗体与AIEFMs偶联制备检测探针,通过优化抗体标记量、探针用量、T线全抗原AFB_1-BSA偶联比和AFB_1-BSA喷涂浓度,建立了无需样品前处理的AIEFMs-LFIA方法用于牛奶中AFM_1的快速检测。实验结果显示,AIEFMs-LFIA定量检测牛奶中AFM_1的回归方程为y=-0.177ln(x)+0.2672(R~2=0.9915),IC_(50)和LOD值分别为0.2684μg/kg、0.0280μg/kg,线性范围为0.0492～1.5625μg/kg。其LOD是乳及乳制品中AFM_1国家限量标准(0.5μg/kg)的1/17.8。全脂乳、脱脂乳和生牛乳等实际样品的加标回收实验结果显示,全脂乳的加标回收率为85.6%～101.7%,脱脂乳的加标回收率为92.0%～107.8%,生牛乳的加标回收率为81.1%～109.7%,变异系数均<10%。上述结果表明,AIEFMs-LFIA能够实现对牛奶中AFM_1的高灵敏度、高特异性检测,方法准确可靠。